一、蛇毒类凝血酶的研究进展（论文文献综述）
李家祺,李谦,唐松山,李红枝[1]（2013）在《蛇毒类凝血酶基因工程的研究进展》文中认为蛇毒类凝血酶（Thrombin-like enzyme,TLE）是蛇毒中与血浆凝血酶性质相似的一类丝氨酸蛋白酶,所不同的是在蛇毒类凝血酶结构中已经没有纤维蛋白稳定因子激活组分。由于蛇毒类凝血酶在新药研究中扮演重要角色,比如来自Bothrops jararaca和Bothrops atrox蛇毒的立芷雪、来自东北白眉蝮蛇毒的邦停和来自尖吻蝮蛇毒的苏灵,它们是具有止血作用的新药;来自Gloydius shedaoensis和Gloydius ussuriensis蛇毒的东菱克栓酶、来自白眉蝮蛇和尖吻蝮蛇毒的降纤酶、来自Calloselasma rhodostoma蛇毒的安克洛酶和来自Crotalus adamanteus蛇毒的Crotalase,它们是具有溶栓作用的新药。这些药用蛋白质的来源和产量因有限的蛇毒原料而有很大限制,通过基因克隆可解决资源问题。文章综述了蛇毒类凝血酶的基因结构、糖基化特点和各种重组表达体系,为大量制备供临床和基础研究使用奠定基础。
曾福星[2]（2012）在《蛇毒类凝血酶AhVTV-1和四种蛇毒磷脂酶A2的结构功能研究》文中进行了进一步梳理蛇毒中含有丰富的蛋白酶类,如蛇毒类凝血酶和蛇毒磷脂酶A2（PLA2）等。这些蛇毒蛋白酶类不仅有相应底物的酶催化水解活性,还具有广泛的生物学功能。蛇毒类凝血酶都是通过第195位的丝氨酸攻击并切断纤维蛋白原分子的Arg-Gly肽键,以此产生水解作用。蛇毒PLA2则能够催化磷酸甘油三酯的sn-2位酯键的水解,生成脂肪酸和溶血磷脂。蛇毒类凝血酶和蛇毒PLA2都具有诸如溶血、凝血、抗菌、细胞毒性和神经毒性等功能,除此之外,蛇毒蛋白还能够结合到特定细胞受体上,影响细胞的功能调控。细胞内Ca2+浓度的调节对于维持细胞静息态下胞内低Ca2+浓度、调节细胞兴奋性、参与质膜上的Na+/Ca2+交换以及细胞的发育、老化和健康都非常重要。肌浆网钙库是平滑肌细胞内的主要Ca2+存贮库,钙库Ca2+释放对肌细胞兴奋-收缩耦联的触发起决定作用。在平滑肌细胞的肌浆网膜上,存在两类Ca2+释放通道：Ryanodine受体（RyRs）和IP3受体（IP3Rs）。两类通道协同调节肌浆网钙库Ca2+释放,引发平滑肌细胞兴奋并收缩。江浙蝮蛇粗毒在经过两步层析纯化并经过精氨酸酯酶活性的测定,得到蛇毒类凝血酶AhVTL-I。利用N端测序及3’-RACE RT-PCR得到了该蛋白的氨基酸序列。AhVTL-I包含239个氨基酸,与多数蛇毒类凝血酶具有较高同源性。序列分析表明AhV TL-I为糖蛋白,其糖含量约11%。它具有精氨酸酯酶活性和纤维蛋白原水解活性,并可被PMSF和Cysteine完全抑制,但一些天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂（如SBTI、Leupeptin和Heparin）对其酶活只具有部分抑制效应。纳摩尔级浓度的AhVTL-I即能够引起分离的小鼠胸主动脉环产生收缩效应,并且这种活性与其酶活性无关。研究发现,AhVTL-I并不激活平滑肌细胞膜上的K+通道和Ca2+通道,却能够通过间接的调控激活细胞内肌浆网膜上的RyRs的开放。在AhVTL-I的晶体结构模型中,能观察到Asn95A上糖基化修饰的存在。对其结构进行分析发现,Asn95-寡糖对99-loop的构象产生了非常大的影响。糖基化的修饰使得99-loop被“压扁”,从而向两侧伸展。伸展的结果导致99-loop远离类凝血酶的底物结合位点S2并占据结合位点S3/S4。99-loop的挤压同样使得174-loop更凸向蛋白表面,两者之间形成的底物结合裂缝消失。这从底物的亲和性方面解释了AhVTL-I只具有较低酶催化活性的原因。另一方面,Asn95A-寡糖位于底物结合口袋上方,形成一种“糖介导的空间障碍”,同样降低了酶对底物的水解活性。去糖实验表明Asn95A-寡糖链的切除能够部分提高AhVTL-I的酶催化活性,验证了我们对其结构分析上的猜测。37-loop上氨基酸的突变使得其天然大分子抑制剂结合位点的电性发生巨大改变,大量正电荷氨基酸的聚集改变了AhVTL-I对抑制剂的选择性。对糖切除的AhV TL-I的功能分析表明,糖基化对于AhVTL-I发挥血管收缩活性是必须的。这为蛇毒糖蛋白的研究提供了全新的视角。江浙蝮蛇粗毒和竹叶青粗毒经过多步层析法能够分别得到AhVbPA、 AhVaPA和PA2-Vb、CTs-R6四个蛋白,它们皆属于蛇毒PLA2家族。序列分析表明,AhVbPA和CTs-R6属于碱性PLA2,AhVaPA和PA2-Vb为酸性PLA2。49位残基的不同可将这四种蛇毒PLA2分为两类：CTs-R6属于Asn49-PLA2,其余三者属于Asp49-PLA2。因此CTs-R6不具有磷脂水解活性,而AhVbPA具有中等酶活性,AhVaPA和PA2-Vb具有较高酶活性。对四者的结构分析表明,CTs-R6中Ca2+结合位点的变化使得其无法结合Ca2+离子,从而丧失酶催化活性。而酸性PLA2和碱性PLA2中i-face上的氨基酸变化使得两者的酶活性产生了较大的差异。AhVTL-I在溶液中主要以二聚体形式存在,二聚体界面由C-loop和Ca2+-loop组成。PA2-Vb也具有二聚化的倾向,其在晶体中的二聚化作用界而主要由疏水的i-face构成。在AhVbPA结构中有天然甘油磷脂的存在,它在AhVbPA中的定位对于研究PLA2结合底物的方式提供了很好的帮助。除CTs-R6外,其余三种蛇毒PLA2都具有收缩小鼠胸动脉环的能力,并且与它们的酶活性无关。三种蛇毒PLA2分子同样不激活质膜上的离子通道的开放,而是通过间接的方式激活细胞内肌浆网上的IP3Rs来产生钙库Ca2+释放,从而引发平滑肌细胞的兴奋-收缩耦联。通过在组织和细胞层面对蛇毒蛋白激活Ca2+释放的实验进行分析,我们提出了AhVTL-I和AhVbPA、AhVaPA、PA2-Vb调节钙库Ca2+释放的机制：蛇毒蛋白一方面可能通过结合到质膜上的特定受体上,引起受体构象变化,释放信使分子,信使分子通过胞内传递途径激活肌浆网的RyRs或IP3Rs;另一方面,蛇毒蛋白可能结合到质膜上的DHPR通道（或BKca、TRPC通道）,通过通道与RyRs（或IP3Rs）的物理联系调控RyRs（或IP3Rs）的激活。RyRs或IP3Rs释放的钙库Ca2+进一步正反馈激活各种离子通道,诱发胞外Ca2+内流,刺激细胞收缩机器,产生收缩效应。这些研究结果为蛇毒类凝血酶和蛇毒PLA2的功能研究提供了新的方向。
张丹丹,王维亭,赵专友[3]（2012）在《蛇毒类抗血栓蛋白酶的研究进展》文中研究表明血栓栓塞性疾病严重威胁人类健康,研究具有优势的抗栓药物是当代医学的重点和热点之一。蛇毒中存在3类具有抗栓作用的蛋白酶,分别为蛇毒类凝血酶、纤维蛋白（原）溶解酶、纤溶酶原激活剂。对这3类抗血栓蛋白酶进行了综述,分别介绍了各类酶的分布、结构、生化性质以及作用机制,并结合其性质及机制分析在抗栓方面存在的优点和不足。另外,还介绍了蛇毒类抗血栓蛋白酶的研究现状,临床应用情况,以及临床常用的一些成熟药物。
欧光武[4]（2010）在《尖吻蝮蛇凝血酶对手术切口止血有效性及安全性的临床研究》文中研究表明目的:评价注射用尖吻蝮蛇凝血酶对胸部、腹部手术切口的止血效果,并评估其对机体凝血功能的影响及其安全性。方法:采取随机、双盲单模拟、安慰剂平行对照的研究方法。胸部手术20例、腹部手术60例共80例患者进入本试验,将其按3:1的比例分为研究组（60例,静注尖吻蝮蛇凝血酶2.0u）和对照组（20例,静注模拟尖吻蝮蛇凝血酶2.0u）。药物按编号的顺序在术前30min予静脉注射,手术过程中对胸、腹部手术切口的长度、深度进行测量计算,并记录手术切口的止血时间、出血量、单位面积出血量。为监测药物对机体凝血功能及安全性影响,于术前、术中10min,术后1天、术后3天对机体凝血功能指标和术前、术后3天对安全性指标等进行监测,整个试验过程中密切观察是否有相关的不良事件发生。结果:研究组和对照组在手术切口的长度、深度、面积上的比较无显着性的差异（P>0.05）。研究组和对照组的平均切口长度分别是8.89±0.85 cm、8.57±1.00 cm,平均切口深度分别为0.91±0.34 cm、0.77±0.22 cm,平均切口面积分别为16.33±6.39 cm2、13.45±4.72 cm2。术中观察得研究组在切口出血时间、出血量、单位出血量均比对照组少,统计学上有显着性差别（P<0.05）。研究组和对照组的平均止血时间分别为128.49±71.04 s、177.19±77.31s;切口平均出血量分别为2.70±1.94 g、4.35±2.10 g;平均单位面积出血量分别为0.19±0.17 g/cm2、0.35±0.17 g/cm2。在胸部手术中,研究组和对照组平均止血时间分别为173.33±78.03 s和191.60±79.79 s,切口平均出血量分别为4.00±2.93 g和4.84±1.41 g,平均单位面积出血量分别为0.34±0.24 g/cm2和0.38±0.08 g/cm2,相比无显着性差异（P>0.05）。而腹部手术中,研究组和对照组平均止血时间分别为113.87±62.82 s和172.69±78.62 s,切口平均出血量分别为2.28±1.27 g和4.19±2.29 g,平均单位面积出血量分别为0.15±0.09 g/cm2和0.34±0.19 g/cm2,研究组均少于对照组（P<0.05）。手术前后的安全性情况,检测记录的机体凝血指标（PT、APTT、TT、Fib、FLT）及安全性指标（生命体征、心电图、肝肾功能、血常规、尿常规等）,研究组与对照组的手术前后结果差异无统计学意义（P>0.05）。整个试验中患者应用试验药物后无发生相关的不良事件。结论:尖吻蝮蛇凝血酶在胸部手术中,切口止血效果不明显。但其对腹部手术切口有较好的止血作用,能明显缩短手术切口出血时间,减少手术切口单位面积的出血量,并且对于机体凝血功能系统无明显影响,是一种安全、可靠的止血药。
欧光武,李威[5]（2010）在《尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状》文中认为尖吻蝮蛇类凝血酶是我国正在研究的一种新止血药,其结构与以往的类凝血酶完全不同。目前的研究表明,该凝血酶具有良好的止血效果及广阔的临床应用前景。
李恒[6]（2010）在《白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒类凝血酶的分离纯化及性质研究》文中研究表明近几十年以来,血栓性疾病严重危害着人类的健康,并且这类疾病的发病率还有逐年上升的趋势。因而开发一类高效廉价、无毒副作用的新型溶栓药物成为一项重要而紧迫的工作。蛇毒类凝血酶是一类具有溶纤活性的丝氨酸蛋白酶类,在蝰科蛇类的蛇毒中分布最广,含量最为丰富。自Klobusitzki和Konig于1936年首次从美洲矛头蝮蛇（Bothrops jararaca）的毒液中得到了部分纯化的类凝血酶,迄今生物科技工作者已发现在30余种毒蛇的毒液中含有该组分,并分离纯化出20余种类凝血酶。目前,我国已将蛇毒类凝血酶制成抗栓药物投入临床应用,这其中包括：降纤酶、蕲蛇酶、东菱克栓酶等。与人凝血酶结构不同,蛇毒类凝血酶均为单链结构；另外几乎所有的蛇毒类凝血酶都是糖蛋白,其含糖量差异较大,约为5%～20%。目前,国内外对白唇竹叶青蛇毒类凝血酶的分离纯化及性质研究还未见报道。本研究以白唇竹叶青蛇毒为研究对象,从中纯化出一种没有出血活性的类凝血酶,主要研究工作如下：通过Sephadex G-100凝胶层析,DEAE-Sephadex A-25离子交换层析和Sepharose-肝素亲和层析三步色谱法,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出一种分子量为63.1KDa的类凝血酶（TA-2）。SDS-PAGE电泳结果显示,该酶在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明TA-2仅由单一肽链构成,并测得其糖含量为6.0%。将该酶与纤维蛋白原在37℃孵育2小时,可水解纤维蛋白原Aα链,对Bβ链和γ链没有降解作用；抑制剂EDTA,对酶活力没有影响,而PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）对酶活力有明显抑制作用,显示该组分为一种丝氨酸蛋白酶。Fe2+Zn2+ Cu2+对酶活力有明显的抑制作用；该酶在pH4.5-9.5、25℃-45℃范围内都有较强活性。动物实验显示TA-2没有出血活性和水肿活性,能延长小鼠尾部出血时间,说明该组分在体内表现为抗凝。
杨大苹[7]（2010）在《蛇毒类凝血酶及叶绿素结合蛋白的高活性表达及功能分析》文中研究说明功能性蛋白的高效、高活性重组表达在蛋白质医药以及生物化学研究领域中占据十分重要的地位。但是每一个功能性蛋白都具有特异性,没有一个普遍适用的策略来获得高效、高活性表达的重组蛋白,因此有必要开发不同的策略去表达不同的功能性蛋白。本论文选取了两个比较有代表性的难以表达的功能性蛋白,即动物体系来源的蛇毒类凝血酶和植物体系来源的叶绿素结合蛋白来探索功能性蛋白的高效高活性表达策略。蛇毒类凝血酶是临床治疗血栓病的国家基本药物,由于蛇毒资源有限,天然酶生产面临严峻的挑战,所以利用基因工程手段获得重组蛇毒类凝血酶是满足需求的有效途径。但目前表达量和活性都难以满足大规模制备的要求,是该领域的难点。叶绿素结合蛋白Pcb（prochlorophyte chlorophyll a/b binding protein）结合不同的叶绿素能使光合生物在不同的光照及营养环境下利用光能。深海单细胞蓝细菌Acaryochloris marina以Chlorophyll（Chl）d为主要的捕光色素能利用一般光合物质（Chlorophyll a,b,c）不能利用的远红外光（690～750 nm）,从而适应阴暗的生存环境。而几乎所有的有氧生物,从蓝细菌到植物都以Chi a为主要的色素。在蓝细菌Acaryochloris marina中,Chl d几乎完全替代Chi a行使功能。将结合Chl d的捕光蛋白PcbA转入只含Chl a的蓝细菌,不仅能揭示叶绿素的替代机制,而且也将提供一个系统来探讨光合生物中各种不同捕光策略的功能及其进化机制。本论文主要研究蛇毒类凝血酶和叶绿素结合蛋白这两个功能性蛋白的高活性表达。（一）蛇毒类凝血酶的表达及功能鉴定大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶在大肠杆菌表达系统中以非融合及融合形式进行表达时,并未获得高效、高活性的重组表达。相比于大肠杆菌,甲醇酵母表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等优势,在基因工程领域中得到日益广泛的应用。但是前期工作表明,以非融合形式在甲醇酵母表达系统中表达大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶时不能获得理想的表达量。本研究工作从融合的表达策略来研究大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶在毕赤酵母中的高效、高活性重组表达。热休克蛋白（Heat Shock Protein70）是分子伴侣,具有帮助蛋白质正确折叠的功能,已在毕赤酵母中获得高活性高水平的表达（120mg／L）。因此通过将热休克蛋白（Hsp70）与蛇毒类凝血酶的N端融合表达来提高类凝血酶的高效、高活性表达水平。1)毕赤酵母表达重组大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶以Hsp70作为融合标签构建了pPIC9K-hsp70/tle表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株。通过SDS-PAGE分析和Western blot（抗蝮蛇血清做为一抗）证实重组蛇毒类凝血酶获得表达。最佳表达条件为pH 6.0,诱导时间为36小时,甲醇诱导表达浓度为1%,培养基为营养丰富的复合培养基。2)重组蛇毒类凝血酶的分离纯化采用Q Sepharose HP阴离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析2步层析方法,从培养上清中分离纯化获得,产量为44.5 mg／L,较以前报导的在毕赤酵母中以非融合形式表达的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的表达量（10 mg／L）提高了近五倍。活力回收率为67.5%。比活力为33.70 U／mg。纯化后的重组蛇岛蝮蛇类凝血酶经SDS-PAGE分析为单一条带,其表观分子量98 kDa。3)重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的酰胺水解活性①以人工合成三肽Nα-p-tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide为底物,重组蛇毒类凝血酶的酶活性最适温度为50℃,最适pH为7.5；②抑制剂的影响：丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（5 mM）和TLCK（10 mM）分别抑制了重组酶93%和36%的酰胺水解活力,表明重组蛇毒类凝血酶属于丝氨酸蛋白酶家族。抑制剂苯脒只抑制了57%酶活力。EDTA不影响酰胺水解活力,表明大连蛇岛蝮蛇类凝血酶不是金属蛋白水解酶。4)重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶对纤维蛋白原的凝结及裂解活性①重组蛇毒类凝血酶纤维蛋白原凝结活性为499.8 U／mg；②重组蛇毒类凝血酶对纤维蛋白原的裂解方式为：优先裂解Aa-链,然后裂解Bp-链,但不裂解γ-链。（二）叶绿素结合蛋白PcbA的表达及生理活性蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803是仅含有Chl a,并且利用藻胆体为捕光天线的蓝细菌,也是基因工程方法制备藻类蛋白的常用工程菌。表达载体pWS19K是通过psbAⅢ的上下游序列将目的基因序列同源重组入蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803的基因组中。psbAⅢ与psbAⅡ是蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803光合系统Ⅱ中D1蛋白的编码基因,替换任何一个编码基因都不会影响蓝藻的生理活性,因此psbAⅢ替换为pcbA（编码蛋白PcbA）的基因序列不会影响Synechocystis sp. PCC 6803中光合系统Ⅱ的光合性质。表达的重组PcbA可以定位于类囊体膜中并与光合系统Ⅱ结合。利用此重组系统不仅可以研究Ch1 a与PcbA的结合机制,而且也可以研究光合作用生物不同捕光策略的调剂机制及进化发展。1)重组叶绿素结合蛋白PcbA的表达将pcbA基因的3’端加入6xHis-tag构建入pWS19K质粒载体中,转化Synechocystis sp.PCC6803。PCR反应证实pcbA基因已经插入到菌株中psbAⅢ基因位点。SDS-PAGE和western blot方法（anti His-tag做为一抗）证实pcbA因获得了表达,分子量38 kDa左右与预测的理论分子量相符。2)重组叶绿素结合蛋白PcbA的生理活性①重组叶绿素结合蛋白PcbA在宿主中的定位及结合性质通过去垢剂n-dodecyl-β-D-maltoside提取转化菌株的类囊体膜进行SDS-PAGE及western blot证实重组PcbA位于类囊体膜。类囊体膜含有光合系统（PS）Ⅰ/Ⅱ, Blue-Native电泳可以将其分离,并分离的PSⅠ/PSⅡ进行western blot（anti His-tag, anti D1分别做为一抗）分析显示重组PcbA与PSⅡ结合,二维电泳及蛋白印迹杂交（anti His-tag, anti D1分别做为一抗）也显示了相同的结合性质。②重组叶绿素结合蛋白PcbA的生理活性野生型及重组菌株进行全波长扫描分析表明,重组菌株中的藻胆体减少大约40%而类胡萝卜素的含量升高20%。野生型菌株中是以藻胆体为捕光系统,重组菌株中藻胆体含量升高说明重组PcbA的转入对重组菌株的捕光策略产生影响。PcbA的稳定存在需要叶绿素及类胡萝卜素的结合,重组菌株合成更多的类胡萝卜素可能是用来满足重组PcbA稳定的需要。野生型及重组菌株进行荧光光谱分析：1,选择在435 nm下激发得到荧光发射波谱,室温下重组菌株与野生型相比存在一个额外的～705 nm处的肩峰。77K下,重组菌株与野生型相比存在一个额外的～720nm的肩峰,说明转化的PcbA与Chl a结合改变了宿主中Chl a的光学环境使其发生红移。2,选择在685 nm与720 nm下发射得到荧光激发波谱。室温及77K下,在重组菌株中几乎观测不到藻胆体的激发峰值。这提供了直接证据,说明重组PcbA的转入已经改变了菌体的捕光策略,即藻胆蛋白下调,而膜结合天线系统上调。综上,通过不同的表达策略,即热休克蛋白做为融合部分在毕赤酵母中表达Gloshedobin及synechocysits sp. PCC6803做为表达宿主表达叶绿素结合蛋白,获得了功能性蛋白的高水平、高活性表达。这也证实基于宿主基因组DNA构建的表达载体来表达功能性蛋白是一个获得功能性蛋白的高水平、高活性表达的比较好的策略。
胡慧珍,董淑清[8]（2009）在《蛇毒类凝血酶的研究进展》文中进行了进一步梳理蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的一种毒液,属于生物毒素（biotoxin）,含有多种生物活性成分,其中大部分是酶和多肽[1]。丝氨酸蛋白酶是蛇毒中的重要组成成分,特别是蝰亚科（Crotalinae）和腹亚科（Viperinae）蛇毒,含有大量丝氨酸蛋白酶[2]。
薛雁,李九翔,王宏英,苏珊,孙东[9]（2009）在《蛇毒类凝血酶的研究进展》文中认为
罗晓清,杨化新,金少鸿[10]（2008）在《降纤酶研究进展》文中指出降纤酶（Defibrase）是从尖吻蝮蛇Agkistrodon acutus和长白山白眉蝮蛇Agkistrodon halys ussuriensis蛇毒中提取分离得到的一种类凝血酶。具有显着的去纤、降粘、溶栓等作用,广泛地应用于临床治疗和预防心脑血管血栓性疾病。对降纤酶的生化性质与结构、生产制备、药理作用与临床应用以及质量分析与控制等方面的研究进行了综述。
二、蛇毒类凝血酶的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛇毒类凝血酶的研究进展（论文提纲范文）
（1）蛇毒类凝血酶基因工程的研究进展（论文提纲范文）
| 1 类凝血酶的基因结构 |
| 2 类凝血酶的糖基化和糖量 |
| 3 类凝血酶的表达载体 |
| 3.1 原核表达系统 |
| 3.2 真核表达系统 |
| 3.2.1 酵母系统 |
| 3.2.2 哺乳动物细胞表达 |
| 4 研究展望 |
（2）蛇毒类凝血酶AhVTV-1和四种蛇毒磷脂酶A2的结构功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血管平滑肌细胞中钙库Ca~(2+)释放的调节 |
| 1.1.1 血管平滑肌细胞的性质 |
| 1.1.2 肌浆网钙库Ca~(2+)释放对血管平滑肌细胞的调节 |
| 1.2 Ryanodine受体的研究进展 |
| 1.2.1 RyRs的基本特性 |
| 1.2.2 RyRs的表达 |
| 1.2.3 RyRs的结构 |
| 1.2.4 RyRs的调控 |
| 1.2.5 RyR疾病 |
| 1.3 IP_3受体的研究进展 |
| 1.3.1 IP3Rs的基本特征 |
| 1.3.2 IP_3Rs的表达 |
| 1.3.3 IP_3Rs的结构 |
| 1.3.4 IP_3Rs的调控 |
| 1.3.5 IP_3Rs疾病 |
| 1.4 平滑肌细胞中RyRs和IP_3Rs的协同调节 |
| 1.5 蛇毒类凝血酶 |
| 1.5.1 蛇毒类凝血酶的分类 |
| 1.5.2 蛇毒类凝血酶的结构 |
| 1.5.3 蛇毒类凝血酶的生物学功能 |
| 1.5.4 蛇毒类凝血酶的应用 |
| 1.6 蛇毒磷脂酶A_2 |
| 1.6.1 蛇毒PLA_2的分类 |
| 1.6.2 蛇毒PLA_2的结构 |
| 1.6.3 蛇毒PLA_2的生物学活性 |
| 1.6.4 蛇毒PLA_2的应用 |
| 第2章 蛇毒类凝血酶AhV_TL-Ⅰ的结构及调控RyRs的机制研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 蝮蛇毒中类凝血酶AhV_TL-Ⅰ的分离纯化 |
| 2.1.3 蛋白分子量及序列测定 |
| 2.1.4 晶体生长和衍射数据收集 |
| 2.1.5 AhV_TL-Ⅰ的结构解析 |
| 2.1.6 AhV_TL-Ⅰ的生化活性研究 |
| 2.1.7 血管张力实验 |
| 2.1.8 钙荧光实验监测平滑肌细胞胞浆Ca~(2+)浓度变化 |
| 2.1.9 FITC标记实验 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 AhV_TL-Ⅰ的分离及纯度鉴定 |
| 2.2.2 AhV_TL-Ⅰ的分子量及氨基酸序列 |
| 2.2.3 AhV_TL-Ⅰ的结构解析 |
| 2.2.4 AhV_TL-Ⅰ的总体结构 |
| 2.2.5 AhV_TL-Ⅰ与其它类凝血酶的结构比较 |
| 2.2.6 N-寡糖及99-loop的结构 |
| 2.2.7 174-loop的结构变化 |
| 2.2.8 37-1oop的结构变化 |
| 2.2.9 结构中的其它变化 |
| 2.2.10 AhV_TL-Ⅰ的酶学特征 |
| 2.2.11 N-寡糖对酶活的影响 |
| 2.2.12 AhV_TL-Ⅰ诱导的钙库Ca~(2+)释放引起血管收缩 |
| 2.2.13 AhV_TL-Ⅰ通过激活RyRs来释放钙库Ca~(2+) |
| 2.2.14 N-寡糖和酶活对AhV_TL-Ⅰ血管收缩活性的影响 |
| 2.3 结果讨论 |
| 2.3.1 AhV_TL-Ⅰ结构与功能的关系 |
| 2.3.2 AhV_TL-Ⅰ调节肌浆网Ca~(2+)释放的机制 |
| 2.3.3 小结 |
| 第3章 蛇毒PLA_2(AhV_bPA,AhV_aPA,PA2-Vb,CTs-R6)的结构及调控IP_3Rs的机制研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 蝮蛇毒中PLA_2(AhV_bPA和AhV_aPA)的分离纯化 |
| 3.1.3 竹叶青蛇毒中PLA_2(PA2-Vb,CTs-R6)的分离纯化 |
| 3.1.4 AhV_bPA和AhV_aPA的序列测定 |
| 3.1.5 晶体生长和衍射数据收集 |
| 3.1.6 结构解析 |
| 3.1.7 蛇毒PLA_2酶活测定 |
| 3.1.8 血管张力实验 |
| 3.1.9 钙荧光实验 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 四种蛇毒PLA_2的分离纯化 |
| 3.2.2 四种蛇毒PLA_2的序列分析 |
| 3.2.3 四种蛇毒PLA_2的结构解析 |
| 3.2.4 四种蛇毒PLA_2的总体结构及结构比较 |
| 3.2.5 结构细节 |
| 3.2.6 四种蛇毒PLA_2的酶学特性 |
| 3.2.7 四种蛇毒PLA_2对鼠动脉的活性特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 PLA_2结构与功能的关系 |
| 3.3.2 PLA_2调节肌浆网Ca~(2+)释放的机制 |
| 3.3.3 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 感谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 |
（3）蛇毒类抗血栓蛋白酶的研究进展（论文提纲范文）
| 1 蛇毒类凝血酶 |
| 1.1 SVTLEs的分布 |
| 1.2 SVTLEs的结构研究 |
| 1.3 SVTLEs的生化性质 |
| 1.4 SVTLEs的作用机制 |
| 2 蛇毒纤溶酶 |
| 2.1 蛇毒纤溶酶的分布 |
| 2.2 蛇毒纤溶酶的结构 |
| 2.3 蛇毒纤溶酶的性质 |
| 2.3.1 酶学特性 |
| 2.3.2 出血活性 |
| 2.4 蛇毒纤溶酶的作用机制 |
| 3 蛇毒纤溶酶原激活剂 |
| 3.1 蛇毒纤溶酶原激活剂的分布 |
| 3.2 分子结构与生化性质 |
| 3.2.1 相对分子质量与等电点 |
| 3.2.2 分子结构 |
| 3.2.3 酶学性质 |
| 3.3 作用机制 |
| 4 结语 |
（4）尖吻蝮蛇凝血酶对手术切口止血有效性及安全性的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词索引 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 止血药研究概况和意义 |
| 1.2 国内外蛇毒类凝血酶研究的概况 |
| 1.3 尖吻蝮蛇凝血酶的相关情况 |
| 1.3.1 尖吻蝮蛇的简介 |
| 1.3.2 尖吻蝮蛇凝血酶的研究进展 |
| 1.3.3 注射用尖吻蝮蛇凝血酶的临床试验情况 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 实验药品及保管 |
| 2.2.1 试验药物来源 |
| 2.2.2 药物编盲 |
| 2.2.3 药物发放 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 试验设计 |
| 3.2 病例选择 |
| 3.3 给药方案 |
| 3.4 有效性与安全性指标及观察方法 |
| 3.5 临床疗效及安全性评价 |
| 3.6 不良事件的观察及处理 |
| 3.7 统计学处理 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 入组病例一般情况 |
| 4.2 止血效果 |
| 4.3 对术后凝血功能指标的分析 |
| 4.4 对人体安全性指标的分析 |
| 第5章 分析与讨论 |
| 5.1 尖吻蝮蛇凝血酶的有效性 |
| 5.1.1 凝血酶在机体止血中的作用 |
| 5.1.2 尖吻蝮蛇凝血酶在体内的凝血作用机理 |
| 5.1.3 尖吻蝮蛇凝血酶在胸、腹部手术中的止血效果 |
| 5.2 尖吻蝮蛇凝血酶对凝血功能指标的影响 |
| 5.3 尖吻蝮蛇凝血酶对人体安全性指标的影响 |
| 第6章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状（论文提纲范文）
| 1 尖吻蝮蛇凝血酶的理化特性 |
| 1.1 双亚基结构的血凝酶 |
| 1.2 单链糖蛋白 |
| 2 尖吻蝮蛇凝血酶的制备 |
| 3 尖吻蝮蛇凝血酶的作用机制 |
| 4 尖吻蝮蛇毒类凝血酶的应用 |
| 4.1 止血作用 |
| 4.2 抗血栓作用 |
| 5 尖吻蝮蛇凝血酶研究的展望 |
（6）白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒类凝血酶的分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写一览表 |
| 1.引言 |
| 2.白唇竹叶青蛇毒类凝血酶的分离纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3.白唇竹叶青蛇毒类凝血酶的性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4.全文总结 |
| 5.文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况 |
| 致谢 |
（7）蛇毒类凝血酶及叶绿素结合蛋白的高活性表达及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 蛇毒类凝血酶性质、功能及研究进展 |
| 1.1.1 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.1.2 蛇毒类凝血酶概述 |
| 1.1.3 蛇毒类凝血酶的生理生化性质 |
| 1.1.4 蛇毒类凝血酶重组表达的研究进展 |
| 1.1.5 蛇毒类凝血酶的分离纯化技术 |
| 1.2 叶绿素结合蛋白Pcb的性质、功能及研究进展 |
| 1.2.1 光合系统概述 |
| 1.2.2 叶绿素结合蛋白Pcb概述 |
| 1.2.3 叶绿素结合蛋白Pcb的进化 |
| 1.2.4 叶绿素结合蛋白的体外重组表达及其与叶绿素结合性质的研究进展 |
| 1.2.5 细胞器的分离 |
| 1.3 本论文选题依据和研究内容 |
| 1.3.1 选题依据 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶在毕赤酵母中克隆与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 基因、质粒和菌株 |
| 2.2.2 工具酶 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.3.2 大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶基因在表达载体pPICgK中的克隆 |
| 2.3.3 表达载体转化毕赤酵母细胞GS115 |
| 2.3.4 重组菌株的诱导表达 |
| 2.3.5 酰胺水解活性检测 |
| 2.3.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 2.3.7 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 2.3.8 蛋白浓度测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因的亚克隆 |
| 2.4.2 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆 |
| 2.4.3 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的表达 |
| 2.4.4 表达条件的优化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 重组大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶基因的分离纯化及活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组蛋白的表达 |
| 3.3.2 蛋白样品的制备 |
| 3.3.3 蛋白定量的方法 |
| 3.3.4 Q HP阴离子交换层析 |
| 3.3.5 Superdex 200凝胶过滤层析 |
| 3.3.6 酰胺水解活性 |
| 3.3.7 纤维蛋白酶原凝结活性 |
| 3.3.8 纤维蛋白原裂解活性 |
| 3.3.9 变性聚丙烯凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 3.3.10 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 3.3.11 抑制剂对酰胺水解活力的影响 |
| 3.3.12 最适温度和最适pH值的测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 重组蛇毒类凝血酶的分离纯化 |
| 3.4.2 重组蛇毒类凝血酶活性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 重组叶绿素d结合蛋白PcbA在synechocystis sp.PCC6803中的克隆与表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 基因、质粒和菌株 |
| 4.2.2 工具酶和化学试剂 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3.2 质粒的提取 |
| 4.3.3 样品DNA片段的切胶回收 |
| 4.3.4 样品DNA片段的精制 |
| 4.3.5 叶绿素结合蛋白PcbA基因的表达载体构建 |
| 4.3.6 叶绿素结合蛋白PcbA基因在蓝藻中的转化 |
| 4.3.7 提取基因组DNA |
| 4.3.8 RT-PCR |
| 4.3.9 重组菌株的培养 |
| 4.3.10 类囊体膜的提取 |
| 4.3.11 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE) |
| 4.3.12 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 4.3.13 蛋白浓度定量 |
| 4.3.14 叶绿素含量的测定 |
| 4.3.15 金属螯合层析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 重组PcbA基因的表达载体构建 |
| 4.4.2 重组PcbA基因的表达载体的转化 |
| 4.4.3 RNA水平检测目的基因的转录 |
| 4.4.4 重组PcbA的表达 |
| 4.4.5 重组PcbA的分离纯化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 重组叶绿素d结合蛋白PcbA在宿主中的生理活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 类囊体膜增溶 |
| 5.3.2 蓝绿温和胶电泳 |
| 5.3.3 蛋白质免疫印迹检测 |
| 5.3.4 吸收波谱分析 |
| 5.3.5 荧光光谱分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组PcbA在宿主中的定位 |
| 5.4.2 重组PcbA与类囊体膜光合系统的结合 |
| 5.4.3 重组PcbA与叶绿素的结合 |
| 5.4.4 波谱分析重组pcbA的生理活性 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 重组叶绿素结合蛋白PcbA在宿主中的定位及结合性质 |
| 5.5.2 吸收波谱分析重组PcbA在宿主中的生理活性 |
| 5.5.3 荧光波谱分析重组PcbA在宿主中的生理活性 |
| 5.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 创新点摘要 |
| 参考文献 |
| 附录A 质粒图谱 |
| 附录B 常用仪器设备 |
| 附录C 常用溶液配制 |
| 附录D 质粒DNA的提取 |
| 附录E DNA片段的切胶回收 |
| 附录F DNA片断的精制 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）蛇毒类凝血酶的研究进展（论文提纲范文）
| 1 蛇毒类凝血酶的分布 |
| 2 TLE分子量及分子结构 |
| 3 TLE药理作用 |
| 3.1 对凝血因子和纤溶活性的影响 |
| 3.2 对血小板及止血功能的影响 |
| 3.3 对血液流动性影响 |
| 3.4 抗血栓作用 |
| 4 临床应用 |
| 5 副作用 |
| 5.1 出血 |
| 5.2 耐药性 |
| 5.3 对伤口愈合的影响 |
| 6 蛇毒类凝血酶研究的展望 |
（9）蛇毒类凝血酶的研究进展（论文提纲范文）
| 1 蛇毒类凝血酶的分布 |
| 2 蛇毒类凝血酶的纯化工艺 |
| 3 蛇毒类凝血酶的理化特性 |
| 3.1 分子量及等电点 |
| 3.2 糖基化程度及糖含量 |
| 3.3 二硫键的分布 |
| 4 蛇毒类凝血酶的作用机制 |
| 5 蛇毒类凝血酶在生物体外作用表现 |
| 6 问题与展望 |
（10）降纤酶研究进展（论文提纲范文）
| 1 降纤酶的生化性质与结构研究 |
| 1.1 降纤酶的生化及酶学性质 |
| 1.2 降纤酶的结构研究 |
| 2 降纤酶的生产制备 |
| 3 降纤酶的药理作用与临床应用 |
| 4 降纤酶的质量分析与控制研究 |
| 5 降纤酶研究的展望 |
四、蛇毒类凝血酶的研究进展（论文参考文献）
- [1]蛇毒类凝血酶基因工程的研究进展[J]. 李家祺,李谦,唐松山,李红枝. 药物生物技术, 2013(02)
- [2]蛇毒类凝血酶AhVTV-1和四种蛇毒磷脂酶A2的结构功能研究[D]. 曾福星. 中国科学技术大学, 2012(03)
- [3]蛇毒类抗血栓蛋白酶的研究进展[J]. 张丹丹,王维亭,赵专友. 现代药物与临床, 2012(04)
- [4]尖吻蝮蛇凝血酶对手术切口止血有效性及安全性的临床研究[D]. 欧光武. 汕头大学, 2010(05)
- [5]尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状[J]. 欧光武,李威. 中国医药导报, 2010(12)
- [6]白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒类凝血酶的分离纯化及性质研究[D]. 李恒. 重庆师范大学, 2010(03)
- [7]蛇毒类凝血酶及叶绿素结合蛋白的高活性表达及功能分析[D]. 杨大苹. 大连理工大学, 2010(09)
- [8]蛇毒类凝血酶的研究进展[J]. 胡慧珍,董淑清. 当代畜禽养殖业, 2009(09)
- [9]蛇毒类凝血酶的研究进展[J]. 薛雁,李九翔,王宏英,苏珊,孙东. 蛇志, 2009(02)
- [10]降纤酶研究进展[J]. 罗晓清,杨化新,金少鸿. 中国药事, 2008(11)