一、肝纤维化逆转的研究进展（论文文献综述）
张荣[1]（2021）在《芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察及其抗肝纤维化血管新生的机制研究》文中提出在前期理论、临床与实验研究中我们认识到“毒瘀肝络”是肝纤维化的基本病机,治疗在扶正的基础上强调化瘀通络、解毒散结,以芪术颗粒（黄芪、莪术、白术、丹参等）用于肝纤维化及早期肝硬化的防治。前期研究发现芪术颗粒可减弱肝组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管紧张素（angiotensin,Ang）/酪氨酸激酶受体 2（tyrosine kinase receptors 2,Tie-2）、p38-分裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase,P38 MAPK）、磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）等表达,从而起到减轻肝纤维化的作用,其作用机制可能是影响肝纤维化过程中肝窦毛细血管化。至于芪术颗粒如何影响肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell,LSEC）毛细血管化,需要进一步研究。本研究结合临床、整体动物及细胞实验,进一步完善芪术颗粒对早期肝硬化的临床疗效及其抗肝窦毛细血管化的作用机制。目的:1.通过临床观察芪术颗粒对早期肝硬化气虚血瘀证患者中医证候积分、肝功能、肝纤维化四项及肝脏弹性纤维值的影响,研究芪术颗粒治疗早期肝硬化气虚血瘀证的临床疗效,并评价其安全性。2.通过体内实验（Wistar大鼠）与体外实验（大鼠LSEC）相结合,观察芪术颗粒对四氯化碳（Carbon tetrachloride,CC14）诱发肝纤维化大鼠模型肝窦内皮毛细血管化的影响及其可能作用机制。方法:1.临床试验:选取2019年03月-2021年01月在中国中医科学院广安门医院肝炎门诊及消化科病房就诊的18-65岁早期肝硬化气虚血瘀证患者作为研究对象,随机分为芪术颗粒组和复方鳖甲软肝片组,两组在西医常规治疗的基础上,分别给予芪术颗粒和复方鳖甲软肝片治疗,治疗12周,两组患者分别于治疗前及停药后检查肝功能、肝纤维化四项、肝脏弹性指标,并记录治疗前后中医证候评分。2.动物实验:雄性健康无特定病原体动物（specified pathogen free,SPF）级Wistar大鼠40只,其体重约180～200g,随机分为正常组、模型组、复方鳖甲软肝片组和芪术颗粒组,除正常组大鼠外其它各组大鼠均腹腔注射40%CC14橄榄油溶液,以3ml/kg的剂量每周2次,连续注射4周制造大鼠肝纤维化模型,并在建模的同进行药物灌胃。造模4周时,取各组大鼠肝脏组织Masson及HE染色来评估肝损伤及肝纤维化程度,造模成功后处死各组大鼠,取肝组织免疫组化方法染色检测α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、高度糖基化的i型跨膜糖蛋白（cluster-of-differentiation-34,CD34）、血小板内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31）的表达,并进行图像分析,同时进行新生微血管密度（microvessel density,MVD）分析,Western blot法检测各组大鼠肝组织毛细血管内皮陷窝蛋白-1（Caveolin-1）、Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor,vWF）蛋白的表达。3.细胞实验:将Wistar大鼠腹腔注射40%CC14橄榄油溶液4周诱导肝纤维化,通过原代分离正常大鼠LSEC及肝纤维化大鼠LSEC。制备正常大鼠含药血清、芪术颗粒含药血清、复方鳖甲软肝片含药血清。正常组（正常大鼠LSEC+正常大鼠血清）、模型组（肝纤维化大鼠LSEC+正常大鼠血清）、芪术颗粒组（肝纤维化大鼠LSEC+芪术颗粒含药大鼠血清）、复方鳖甲软肝片组（肝纤维化大鼠LSEC+复方鳖甲软肝片含药大鼠血清）分别常规培养48h。采用台盼蓝染色及流式细胞术鉴定各组LSEC,电镜下观察各组大鼠LSEC的窗孔情况;Western Blot检测各组大鼠LSEC表型CD31、SE-1（大鼠肝窦内皮细胞标记物）及整合素α Vβ 3-黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）-R as/丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路及相关蛋白表达情况。结果:1.临床试验（1）两组患者一般资料比较:本研究共60例早期肝硬化气虚血瘀证患者完成了临床观察,芪术颗粒组30例（男性17例,女性13例）,年龄均值为53.53±6.83岁,病程6.23±3.24年,Child-Pugh评分均为A级;复方鳖甲软肝片组30例（男性16例,女性14例）,年龄均值为54.13±6.21岁,病程6.00±2.83年;Child-Pugh评分均为A级。两组早期肝硬化患者病因均以乙型肝炎病毒为主。两组患者一般资料比较差异无统计学意义。（2）肝功能的影响:芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组患者治疗前血清谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）对比差异无统计学意义（P>0.05）,治疗12周结束后两组患者血清AST和ALT的均值较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.05）,且两组患者治疗后血清AST和ALT均恢复到正常水平,两组患者治疗后血清AST、ALT比较差异无统计学意义（P>0.05）。（3）纤维化四项的影响:两组早期肝硬化患者治疗前血清Ⅲ型前胶原（procollagen type Ⅲ,PC-Ⅲ）、层粘连蛋白（laminin,LN）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）及 Ⅳ 型胶原（collagen type Ⅳ,Ⅳ-C）比较差异无统计学意义（P>0.05）,治疗12周后,芪术颗粒组患者血清PC-Ⅲ、LN、HA及Ⅳ-C的均值均较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.01）。复方鳖甲软肝片组患者血清PC-Ⅲ、LN、HA及Ⅳ-C的均值较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（4）肝脏弹性值的影响:本研究纳入的60例早期肝硬化气虚血瘀证患者肝脏弹性值均高于正常水平,早期肝硬化患者给与芪术颗粒治疗后肝脏弹性值较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（5）中医证候疗效及安全性分析:芪术颗粒治疗12周后患者食欲不振、神疲乏力、肝区（胁肋部）疼痛、气短懒言、胸闷善太息的症状均得到改善（P<0.01）,芪术颗粒中医证候总有效率为93.33%,高于复方鳖甲软肝片组,其中在改善患者神疲乏力、气短懒言症状,芪术颗粒明显优于复方鳖甲软肝片（P<0.05）。芪术颗粒在缓解早期肝硬化气虚血瘀证患者中医证候上具有明显优势且无不良反应的发生。2.动物实验（1）对肝纤维化大鼠肝脏病理的影响:4周后处死大鼠,取正常组、模型组、芪术颗粒组复方鳖甲软肝片组肝组织进行Masson和苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin,HE）,结果模型组大鼠肝组织出现增生的纤维组织和纤维隔形成,表明本研究大鼠肝纤维化模型造模成功,同时芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组大鼠肝纤维化程度较模型组减轻。（2）对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA的表达的影响:正常组大鼠肝组织α-SMA表达很低,肝纤维化大鼠模型组肝组织α-SMA表达明显升高（P<0.05）。与模型组相比,芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组肝组织α-SMA表达显着降低（P<0.05）。（3）对肝纤维化大鼠肝组织中CD31、CD34表达的影响:免疫组化染色检测各组大鼠肝组织中CD31、CD34的表达,其中模型组肝组织染色强度最强,芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组肝组织中CD31、CD34平均光密度面积比较模型组明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）对肝纤维化大鼠肝组织中vWF、Caveolin-1蛋白表达的影响:正常大鼠肝组织很少表达vWF和Caveolin-1蛋白,vWF和Caveolin-1蛋白的表达水平在大鼠肝纤维化过程中显着增加。与肝纤维化模型组比较,芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组肝纤维化大鼠肝组织中vWF及Caveolin-1蛋白的表达降低（P<0.05）。（5）对肝纤维化大鼠肝脏新生MVD的影响:分别用CD31、CD34标记对各组大鼠肝脏组织进行新生MVD分析,经CC14处理后,模型组大鼠肝脏组织中MVD明显增加,明显高于正常组大鼠（P<0.05）。CCl4诱导大鼠肝纤维化的同时给予芪术颗粒或者复方鳖甲软肝片灌胃处理,大鼠肝组织新生MVD明显减少,与模型组大鼠肝组织相比差异有统计学意义（P<0.05）。3.细胞实验（1）LSEC的观察:台盼蓝染色结果显示模型组与正常组LSEC的细胞存活率无明显差异。流式细胞术结果显示正常组及模型组LSEC中CD146+细胞和SE-1+细胞的比例均在90%以上。（2）对肝纤维化大鼠LSEC窗孔的影响:在扫描电镜下,正常LSEC的表面可见许多窗孔,模型组出现LSEC窗孔的减少,肝纤维化LSEC经芪术颗粒药物血清处理后LSEC窗孔增加。（3）对肝纤维化大鼠LSEC表型的影响:模型组大鼠LSEC表达CD31和SE-1的量明显高于正常组（P<0.05）。与肝纤维化大鼠模型组比较,芪术颗粒组LSEC中CD31和SE-1的表达明显降低（P<0.05）。（4）对肝纤维化大鼠LSEC整合素α Vβ 3-FAK-R as/MAPK信号通路的影响:与正常组比较,模型组大鼠LSEC整合素α Ⅴ β 3/GAPDH比值显着升高（P<0.01）,肝纤维化大鼠LSEC给予芪术颗粒含药血清处理后,LSEC中整合素α Ⅴβ 3/GAPDH比值降低（P<0.01）。与正常组比较,模型组大鼠LSEC中p-FAK/FAK、p-MAPK/MAPK比值均显着升高（P<0.01）,芪术颗粒含药血清处理肝纤维化大鼠LSEC后,LSEC中p-FAK/FAK、p-MAPK/MAPK比值降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与复方鳖甲软肝片组对比,芪术颗粒组整合素αV β 3蛋白表达水平下降更为明显（P<0.05）。结论:1.芪术颗粒治疗3月后可明显改善早期肝硬化气虚血瘀证中医证候评分,使转氨酶恢复正常,并改善患者肝纤维化指标,可降低早期肝硬化气虚血瘀证患者肝脏弹性值。2.芪术颗粒可显着抑制CCl4诱导肝纤维化大鼠的纤维化,可减少肝纤维化肝组织中CD31、CD34、vWF和Caveolin-1的表达,降低肝窦微血管密度,减少肝窦微血管增生,防止肝窦毛细血管化。3.芪术颗粒可减轻肝纤维化过程中肝窦毛细血管化,其机制为抑制肝纤维化过程中LSEC窗孔的减少,改善肝纤维化过程中LSEC的表型,同时可调控LSEC中整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路发挥抗肝窦毛细血管化作用。
侯丽爽[2]（2021）在《芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究》文中研究说明目的:肝纤维化一种结缔组织异常增生的病理过程,伴随胶原蛋白大量合成及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积。诱因主要包括酒精、药物、代谢紊乱、病毒感染、免疫性肝炎和胆汁淤积等。在世界范围内,肝纤维化引起的肝硬化和肝癌,是肝病发病率和死亡率的主要原因。肝病的发病率逐年增加,使我国成为肝病大国,严重损害人民健康,加重社会负担。目前的疗法,包含药物及纤维源性标记物等技术。但需要结合大量临床评估,才能确保其有效性。化学合成药物在改善病毒性肝炎方面已有临床报道,但对纤维结缔组织的增生,仍缺乏针对性。中药组分或有效成分,在抗肝纤维化方面展现明显优势。课题组发现天然植物芝麻,具有抗炎抗氧化药理活性,推测可能对肝病有改善作用。为此,选择其主要活性成分芝麻素和芝麻酚,验证对肝纤维化的改善作用。由于芝麻素和芝麻酚在抗肝纤维化中的作用机制仍然不明确,制约了新药的开发与应用。因此,本研究开展了芝麻素和芝麻酚在体内外抗肝纤维化的研究,解析抗肝纤维化的机制,为肝纤维化的临床治疗提供药理学参考,并为新药的研发提供理论基础。芝麻素（sesamin,SES）和芝麻酚（sesamol,DER）是一种天然的木酚素类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。但对肝纤维化的干预效果还不明确。因此,本课题主要研究SES和DER改善肝纤维化的相关机制。具体为:SES如何调节法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）和小异二聚体伴侣（short heterodimer partner,SHP）,在体内外干预炎症及肝纤维化;DER介导FXR/肝X受体（liver X receptor,LXR）信号调控硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）或雷帕霉素（rapamycin,RA）诱导的肝损伤、炎症、自噬及肝纤维化的机制研究;DER抑制大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells-T6,HSC-T6）的活化,调控FXR/LXR信号串扰,参与THP-1巨噬细胞及人肝星状细胞（LX-2）的交互,抑制肝星状细胞活化。方法:（1）在SES改善TAA诱导的肝纤维化模型中,采用C57BL/6小鼠,分为6组:正常组、TAA组、TAA和SES（20 mg/kg）组、TAA和SES（40mg/kg）组、TAA和Curcumin（Cur）（20 mg/kg）组以及单独的SES组。除正常组和单独SES组,其他组小鼠腹膜内注射TAA连续5周,第1周每周3次100 mg/kg,第2至5周每周两次200 mg/kg。此外,在给药组中,从第二周开始连续28天,以口服灌胃法对小鼠进行SES或Cur治疗。同时,正常组和TAA组施用等量生理盐水4周。在实验结束后,首先检测血清生化指标谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）水平。使用天狼星红染色（Sirius Red）,三色胶原染色（Masson）及苏木精-伊红染色法（H&E）,检查肝脏组织病理学变化。通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色,检测相应抗体的表达。最后,采用蛋白印记与实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription PCR,q RTPCR）结合的方式,检测纤维化及炎症的水平。在体外,先用TGF-β激活HSCs2h,然后给予SES（3.125,6.25,12.5μM）,FXR的激动剂GW4064（2μM）或FXR的抑制剂Gugglusterone（50μM）处理2h。通过免疫荧光,蛋白印记,q RT-PCR等方法,检测FXR,SHP,α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,核苷酸结合域-（NOD-）样受体蛋白3（nucleotide-binding domain-（NOD-）like receptor protein 3,NLRP3）,白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）,白介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）等蛋白的表达情况。采用特异性基因阻断FXR（si FXR）和SHP（si SHP）转染HSCs,通过蛋白印记和q RT-PCR检测相关蛋白的表达。（2）在DER改善TAA诱发肝纤维化模型中,采用C57BL/6小鼠,随机分为6组:正常组、TAA组、TAA和DER（10 mg/kg）组、TAA和DER（20 mg/kg）组、TAA和Cur（20 mg/kg）组,及单独的DER（20 mg/kg）组。TAA给药方式同SES。在给药组中,从第二周开始连续28天,以口服灌胃法对小鼠进行DER（10、20 mg/kg）治疗。同时,正常组、TAA组小鼠,给予等量生理盐水4周。在自噬诱导肝纤维化的模型中,将鼠随机分为5组:正常组、TAA组、TAA和DER（20 mg/kg）组、TAA和RA（2 mg/kg）组、TAA和3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）（10 mg/kg）组。TAA组的给药方式同SES。从第2至5周,除正常组和TAA组,另外二组每周3次腹腔注射RA或3-MA。实验结束后,检测血清生化指标及组织病理学变化。采用蛋白印记与荧光定量逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）、q RT-PCR的方法,测定纤维化指标和炎症因子的表达。体外模型,先用TGF-β激活HSCs,然后给予DER（3.125,6.25,12.5μM）进行处理,检测FXR,LXRα/β,微管相关蛋白轻链3α/β（Microtubule-associated protein light chain 3α/β,MAPLC3α/β）和泛素结合蛋白自噬受体（Sequestosome 1,SQSTM1/P62）等相关蛋白的表达。利用转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）激活HSCs后,联合RA和3-MA,给予DER作用后,检测了相关蛋白的表达。另外,用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（0-100 ng/ml）刺激THP-1细胞,收集上清液LPS条件培养基,联合RA激活LX-2细胞。给予DER或3-MA孵育后,检测自噬蛋白及炎症蛋白的表达。用FXR激动剂GW4064,LXR激动剂GW3965及DER处理LX-2细胞,通过RT-PCR及细胞荧光,检测自噬蛋白,α-SMA及炎症相关的蛋白表达。结果:（1）SES显着降低了的ALT、AST水平,改善了TAA导致的组织病理学变化。明显抑制了α-SMA、I型胶原（type I collagen,collagen-I）、金属蛋白酶-1的组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）/基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP13）等纤维化相关标志蛋白及炎症细胞因子的浸润,并上调了FXR、SHP的表达。体外结果显示,SES能明显抑制由TGF-β刺激引起的纤维化标志蛋白的表达。通过蛋白印记,q RT-PCR,细胞免疫荧光方法,证实了SES对NLRP3、caspase-1和IL-1β等炎症因子的调控作用。SES和FXR的激动剂GW4064都能明显提高FXR、SHP的表达,下调α-SMA、IL-1α和IL-6的表达。（2）DER显着降低了TAA引起的血清生化指标ALT、AST水平,改善了组织病理学变化,明显抑制了纤维化标志蛋白及自噬蛋白的表达。DER还下调了炎症细胞因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1）和IL-6等的表达并抑制NLRP3炎性小体的激活。DER与自噬抑制剂3-MA具有相同的功效,显着下调了ALT、AST水平,改善了TAA或RA导致的组织病理学变化。体外结果显示,DER明显抑制了由TGF-β刺激引起的HSCs中纤维化标志蛋白及炎症细胞因子的表达。DER处理后,逆转了TGF-β激活HSCs引起的FXR和LXRα/β蛋白表达的下调。使用TGF-β和RA联合刺激HSCs,DER和3-MA功能相似,抑制了自噬蛋白和炎症细胞因子的释放。收集LPS刺激THP-1细胞的上清液孵育LX-2细胞,DER和3-MA抑制了自噬蛋白、α-SMA和炎症细胞因子的表达。DER通过基因阻断自噬相关蛋白（autophagy Related Protein 7,ATG7）（si ATG7）同样抑制了LPS条件培养基引起LX-2细胞的活化。此外,DER同GW4064或GW3965功能相似,上调了LX-2细胞中FXR和LXR的表达,抑制了自噬蛋白及NLRP3炎症小体的活化。基因沉默FXR（si FXR）和LXR（si LXR）后,DER或3-MA同样抑制了LX-2细胞的活化。结论:（1）SES通过介导FXR/SHP信号通路,抑制了NLRP3炎症小体的活化及炎症细胞因子的表达,减少ECM的沉积及HSCs的活化。通过基因沉默FXR及SHP,验证了FXR和SHP的相互调控作用,并且,SES充当FXR的激动剂,激活FXR及SHP的表达。此外,SES保护肝脏免受TAA毒性的影响,防止胶原蛋白的累积,减少炎症因子对肝脏的损害及组织病理学的变化,改善了肝纤维化。（2）DER通过靶向FXR/LXR信号,参与LX-2细胞和THP-1细胞的交互,抑制LX-2细胞的自噬反应、减少NLRP3炎症小体的活化、caspase-1的裂解及炎症细胞因子IL-1β的产生。DER的作用同3-MA,抑制了HSCs的激活及自噬,降低了TAA引起的纤维化标志蛋白的表达,改善组织病理学的变化,减少NLRP3及炎症因子的浸润,抑制了肝纤维化的发展。此外,DER同3-MA都能抑制肝脏自噬反应,缓解RA引起的自噬对肝脏的损害,减少肝脏炎症及组织病理的改变,发挥肝保护的作用。总之,本研究证实了天然的木酚素类化合物SES和DER,参与FXR/SHP/LXR信号交互,具有改善肝纤维化和抑制炎症的良好功效,防止TAA及自噬对肝脏造成的损伤。DER通过调控巨噬细胞与HSCs细胞间的串扰,发挥改善肝纤维化的作用。SES和DER可作为改善肝纤维化的理想调节剂,并具备天然药物独特的生物活性优势。未来,我们在SES和DER的药代动力学,生物利用度及安全性评价等方面,将会做更多的应用及研究,为临床开发安全、有效、创新的抗肝纤维化药物,奠定良好的理论基础。
宋健[3]（2021）在《基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究》文中认为目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的常见病理基础,并且是慢性肝病发展为肝硬化的必要阶段。肝纤维化的主要特征是激活肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）介导细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积。并且慢性肝脏炎症也会加速肝纤维化的进程。人参皂苷活性成分是人参中主要的活性物质,其药理作用与能量代谢和调控炎症反应有关。人参皂苷具有肝保护、抗氧化、抗炎等广谱的药理活性。核受体肝X受体（liver X receptor,LXRs）与法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）作为调节能量代谢的重要途径,在调控肝纤维化和炎症中发挥重要作用。本课题是基于核受体LXRs与FXR探讨人参皂苷25-OCH3-原人参二醇（25-OCH3-PPD）及20S-原人参三醇（M4）调控肝纤维化的作用与机制研究。方法:1.人参皂苷25-OCH3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠分为六组:正常组、TAA组、TAA+25-OCH3-PPD（5、10、20 mg/kg）给药组和TAA+Silymarin（100 mg/kg）组。25-OCH3-PPD与Silymarin组小鼠通过灌胃的方式给药。除正常组外,其他各组小鼠均通过腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200mg/kg,每周两次）。相关指标的测定:采用H&E染色、Sirius Red染色、Masson染色法检测组织病理学变化。检测血清中ALT、AST变化水平。TUNEL染色法检测25-OCH3-PPD对肝细胞凋亡的影响。在TAA诱导的肝纤维化中,通过蛋白印记、RT-PCR、免疫组织化学染色以及组织荧光染色实验检测细胞外基质、炎症因子、SIRT1、FXR、LXRα、LXRβ、P2X7r和NLRP3等蛋白或m RNA的表达情况。分析了与TAA诱导的凋亡途径相关的几个分子蛋白的表达,包括caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、c FILP。（2）体外实验:选用HSC-T6细胞,TGF-β刺激2 h,然后用25-OCH3-PPD（1、5或10μM）或caspase-1抑制剂I培养6 h。这些细胞被收集,分别做Western blotting以及免疫荧光实验,检测HSC-T6细胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3、LXRβ、LXRα、caspase-1、IL-1β等蛋白的表达水平;并通过免疫荧光染色做进一步验证。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究中:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠随机分成4组:正常组、TAA组、TAA+M4-10组、TAA+M4-20组。小鼠每天采用M4（10和20 mg/kg）或等量生理盐水灌胃处理。除正常组小鼠外,小鼠腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200 mg/kg,每周两次）,以建立小鼠肝纤维化模型。相关指标的测定:采用H&E染色法检测组织病理学变化。提取总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测α-SMA、Collagen I、TIMP-1、MMP-13、FXR、P2X7r、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及免疫荧光染色做进一步验证。（2）HSC-T6细胞体外实验:HSC-T6细胞被TGF-β刺激2 h后,再用浓度为10、20μM的M4或guggulsterone（50μM）或GW4064（2μM）处理4 h。提取细胞总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测HSCs细胞中α-SMA、FXR、P2X7r、caspase-1等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及FXR与P2X7r免疫荧光染色做进一步验证。（3）Hep G2细胞质粒转染（sh RNA-FXR）:对Hep G2细胞给予FXR特异性si RNA转染48 h,然后给予TGF-β培养2 h,再用M4孵育细胞4 h。利用RT-PCR、Westeron blot,以及免疫荧光法检测FXR、α-SMA和P2X7r的表达变化以及IL-1β蛋白表达情况。结果:1.人参皂苷25-OCH3-PPD通过促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的研究:（1）TAA诱导肝纤维化小鼠模型:TAA组小鼠血清ALT、AST水平升高,肝组织发生损伤并有大量胶原沉积;而25-OCH3-PPD可以降低血清中ALT、AST水平;改善TAA诱导小鼠肝脏组织的病理变化以及肝组织中胶原沉积情况;25-OCH3-PPD可以改善肝组织中纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13;降低促炎细胞因子表达水平,包括降低caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;改善肝组织中肝细胞凋亡情况,调控了caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、FILP凋亡途径相关分子蛋白的表达;并抑制P2X7r-NLRP3炎症小体的活化进;抑制PI3K/Akt磷酸化,活化LKB1/AMPK-SIRT1信号通路;25-OCH3-PPD还能改善由TAA诱导的LXRs和FXR的活性降低。（2）体外实验中,25-OCH3-PPD减弱HSC-T6细胞中促纤维化标志物α-SMA的转录活性;25-OCH3-PPD可以通过调控LXRs和P2X7r-NLRP3、P-PI3K/P-Akt的表达降低,抑制肝星状细胞的活化;并且在肝星状细胞中抑制了caspase-1、IL-1β、IL-18的表达,与caspase-1抑制剂I效果一致。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究:（1）在TAA诱导的小鼠肝纤维化中,M4可减轻组织病理学改变,改善肝损伤;M4可以调节肝组织中肝纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13的表达;并降低肝组织中促炎细胞因子表达水平,包括降低F4/80、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;蛋白印记、RT-PCR、组织免疫荧光实验表明,M4显着增加FXR的蛋白和m RNA的表达;M4也抑制了和P2X7r、NLRP3的表达,对P2X7r-NLRP3信号通路具有调控作用。（2）HSC-T6细胞体外实验中,TGF-β刺激后肝星状细胞被活化;给予M4可抑制HSC-T6中细胞外基质（ECM）的沉积包括α-SMA、Collagen-I、TIMP-1的表达,升高MMP-13的表达;以及降低caspase-1、IL-1β、IL-1R1和IL-6等炎症因子的表达水平;M4显着增加了FXR的表达,抑制了P2X7r-NLRP3信号通路,并作为FXR激动剂GW4064发挥作用;M4与GW4064激活FXR,抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1、IL-1β、IL-1R1的表达;（3）并且对Hep G2细胞转染FXR,建立sh RNA-FXR,实现了Hep G2细胞低表达FXR;但给予M4后FXR被激活,活化FXR后进而抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1的表达。结论:人参皂苷25-OCH3-PPD与M4可改善TAA诱导小鼠和活化HSCs中纤维化形成及炎症。25-OCH3-PPD可能激活LXRs,以改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体。并且25-OCH3-PPD可以通过调控LKB1-AMPK信号通路以及激活SIRT1调节TAA诱导的肝纤维化和肝脏炎症。M4改善了TAA诱导的肝纤维化,其调控肝纤维化机制可能通过激活FXR介导P2X7r-NLRP3炎症信号通路。因此,25-OCH3-PPD和M4可能是一种有效的抗肝纤维化和抗肝脏炎症活性物质。
于亚男[4]（2021）在《滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用》文中指出目的:观察不同剂型的滇产铁皮石斛（Dendrobium candidum from Yunnan,DCY）对CCl4诱导肝纤维化大鼠肝组织病理学、肝功能和肝纤维化生化学指标的影响,同时通过体外观察铁皮石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharide,DCP）对活化肝星状细胞系LX2（Hepatic stellate cell LX2,HSC-LX2）增殖、凋亡的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:（1）实验一:选取86只SD大鼠,将其随机分为正常组15只、模型组71只,模型组大鼠行CCl4皮下注射诱导肝纤维化,正常组给予等量生理盐水处理,每周3次,同时称体重。连续注射5周后,随机处死正常组和模型组大鼠各5只,行肝组织病理切片,镜下观察各组肝组织的病理学改变。再随机选取8只正常组大鼠为阴性对照组（NG）,剩余MG 64只大鼠随机分为DCY粉剂组（DDG）、鲜榨组（FDG）、秋水仙碱阳性对照组（CG）和模型组（MG）,其中粉剂组和鲜榨组又随机分别分为低浓度组（DGl,0.15g/m L）、中浓度组（DGm,0.45g/m L）、高浓度组（DGh,0.75g/m L）。DCY的粉剂和鲜榨组分别给药浓度由低到高分别为0.15g/m L、0.45g/m L、0.75g/m L,CG给予秋水仙碱浓度为0.002%,同时MG和NG给予等量生理盐水,各组给药剂量均为3 m L/只,每天灌胃1次。连续灌胃4周后,各组大鼠称体重,断头处死,立即在无菌条件下剖腹行腹主动脉采血,然后观察肝的色泽、质地,并取肝称肝重,计算肝脏指数（Liver index,LI）;采用HE染色、Masson染色法,镜下观察各组肝组织的病理学改变;通过免疫组织化学染色法,检测各组肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达情况;应用血液生化仪检测大鼠血清肝功能指标ALP、AST、GPT的改变,并采用ELISA法检测其血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的变化。（2）实验二:体外传代HSC-LX2,取对数生长期细胞培养,以5×104/孔的细胞密度种入6孔板,分阴性对照组和DCP组进行划痕实验,其中DCP组给予含药浓度为400ug/m L,然后检测HSC-LX2在2 h、6 h、12 h、24 h、48 h的细胞迁移率;另体外培养HSC-LX2,以1×103/孔的细胞密度种入96孔板,分为阴性对照组（NG）、25ug/m L DCP组（DCPG-25）、50ug/m L DCP组（DCPG-50）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,分别给予不同浓度的DCP处理24 h后,采用MTT法检测并计算DCP对HSC-LX2的抑制率;同上方法体外培养HSC-LX2,以5×104/孔的细胞密度接种至6孔板内,分为阴性对照组（NG）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,细胞培养12h时后,低、中、高浓度组分别加入DCP的浓度为100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L,各孔加入同等液量1.5 m L,作用24h后,倒置显微镜下观察细胞形态并进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:（1）实验一:（1）一般情况及肝脏外观的变化:模型制备期间MG大鼠一般状态差,体重呈缓慢上升态势,两种剂型的DCY给药干预后,DDG、FDG、CG三组大鼠一般状态好转。NG大鼠肝脏多分为6叶,呈棕红色,表面滑润,质地柔软;MG大鼠肝脏则偏暗红色,肝表面可见弥漫性小结节,质地偏韧;DDG、FDG、CG三组大鼠肝脏质地较韧并有颗粒感,但与MG比较均有较明显改善。（2）LI变化:与NG比较,MG大鼠LI明显升高（P<0.01）;CG、DDG、FDG的LI较NG偏高,但分别与NG比较差异无统计学意义（P>0.05）;与MG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh、CG的LI均明显降低（P<0.05或P<0.01）;与CG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组的LI偏高,但差异无统计学意义（P>0.05）;与DDGh比较,DDGl的LI降低不明显,有统计学意义（P<0.05）;与FDGh比较,FDGl和FDGm两组的LI变化无统计学意义（P>0.05）。（3）肝组织病理学改变:HE染色显示,NG大鼠肝脏细胞形态正常,核圆居中,肝细胞索呈放射状排列紧密;MG大鼠肝脏细胞排列紊乱,细胞内广泛形成脂肪空泡,可见大量假小叶形成,汇管区扩大,有炎细胞浸润;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤均有明显改善。Masson染色显示,NG大鼠肝组织中的肝细胞形态正常,肝细胞索排列规则,细胞内未见明显脂肪空泡,汇管区无明显胶原纤维沉积;MG大鼠肝细胞索排列紊乱,可见大量假小叶形成,汇管区有大量胶原纤维沉积;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤明显缓解,假小叶形成减少,汇管区纤维化程度降低。随着DCY各剂型给药浓度的增高,大鼠肝组织的病理变化改善更加明显,可能存在剂量依赖性。（4）免疫组织化学染色结果:与NG相比,MG、DDGl和FDGl大鼠肝组织中TGF-β1的表达明显增多（P<0.01）;与MG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组的TGF-β1表达明显降低（P<0.01）;与CG比,DDGl、FDGl、DDGm和FDGm各组的TGF-β1表达差异均十分显着（P<0.01）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm与FDGh相比,TGF-β1的表达差异均有统计学意义（P<0.01）。结果表明,DCY能降低大鼠肝组织TGF-β1的表达水平,且可能有剂量依赖性。（5）肝功能血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清ALP、AST、GPT的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均降低（P<0.01）;与CG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均无统计学意义（P>0.05）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm和FDGh相比,各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。（6）肝纤维化血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清HA、LN、PC-III的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清HA、LN、PC-III的表达均降低（P<0.05）;与CG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组血清HA、LN、PC-III的表达差异无统计学意义（P>0.05）,而DDGl和FDGl均有显着统计学意义（P<0.01和P<0.05）。但值得注意的是,在不同剂量药物干扰组进行组内比较时,仅LN的表达可能存在剂量依赖性,即DDGl与DDGh相比,FDGl与FDGh相比,LN的表达差异均十分显着（P<0.01）。（2）实验二:（1）一般情况:传代的HSC-LX2贴壁后,光镜下显示细胞生长旺盛,胞质透亮,细胞伸展呈星状,核仁清晰,细胞碎片少。（2）划痕实验:给药组细胞迁移率显着降低,表明DCP可通过抑制HSC-LX2的迁移来起到抗肝纤维化的作用。（3）MTT法检测结果:随着DCP给药浓度的增高,细胞增殖抑制率逐渐增高,各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;DCPG-25、DCPG-50、DCPG-100、DCPG-200和DCPG-400各组进行两两比较,HSC-LX2的增殖抑制率均显着较低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明,DCP可抑制HSC-LX2的增殖且呈剂量依赖性。（4）流式细胞术结果:随着给药浓度增加,HSC-LX2的生长密度逐渐降低,细胞凋亡率逐渐升高,并与给药浓度呈正相关。各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;与DCPG-400比较,DCPG-100和DCPG-200凋亡率较低,差异显着,有统计学意义（P<0.01）,表明DCP能显着促进HSC-LX2凋亡且呈剂量依赖性。结论:两种剂型DCY均可改善肝纤维化大鼠的一般状态、肝功能、肝纤维化生化指标以及肝组织的病理变化,并降低肝组织中TGF-β1的表达;DCP能抑制活化的HSC-LX2增殖并促进其凋亡;随着给药浓度的升高,体内外检测指标大部分得到明显改善。因此,铁皮石斛具有抗肝纤维化作用,可能存在剂量依赖性。
吕艳杭[5]（2021）在《基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用》文中研究指明目的:观察柔肝化纤颗粒对四氯化碳（CCl4）复合因素诱导的肝纤维化大鼠模型的干预作用,从PKCα/Nrf2/ROS信号通路方面探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:将48只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗组,每组12只。除正常组外,其余每组大鼠采用皮下注射40%CCl4（第一次使用5ml/kg体重,以后每隔3天以每3ml/kg体重,每周2次,共8周）皮下注射,联合高脂低蛋白食物（以玉米面为饲料,实验第一、二周加用0.5%胆固醇、20%猪油）,为了防止肝纤维化自然修复对实验结果造成的影响,除正常组外,其余各组仍每周腹腔注射一次40%CCl4油剂3ml/kg体重/每次;正常组正常饲养,同时采用同体积花生油皮下注射8周后灌胃给予同体积的生理盐水,肝纤维化模型组造模成功病理模型组于4mg/kg生理盐水灌胃,秋水仙碱组于每日0.11mg/kg体重给予秋水仙碱进行灌胃;柔肝化纤颗粒剂量组予柔肝化纤颗粒溶液4mg/kg灌胃,每周3次,共8周,连续8周取材。各组分别于用药8周后,禁食12h,经1%戊巴比妥麻醉,股静脉采血后处死,开腹剖取肝脏,通过HE染色、Masson染色观察肝脏情况,采用ELLSA检测活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）、超氧化歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量;采用PCR、Western Blot检测平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-Cadherin,E-Cad）、I型胶原蛋白酶（Collagen I,Col I）、III型胶原蛋白酶（Collagen III,Col III）、血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1,HO-1）、醌氧化还原酶1（NAD（P）H:Quinone dehydrogenase1,NQO1）、蛋白激酶C（Protein Kinase C,PKCα）、核因子E2相关因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）m RNA及蛋白表达。结果:1.柔肝化纤颗粒对肝组织的影响正常组大鼠肝组织的肝小叶结构完整,轮廓清晰,肝组织致密,无假小叶结节形成,汇管区及其周围未见小胆管及纤维组织增生,胞核位于中央。病理模型组肝小叶结构被破坏,甚至消失,结节形成,肝索排列紊乱,汇管区大量增生的纤维,呈条索状,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡。秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组均存在肝小叶结构不清晰,汇管区及其周围小胆管可见纤维组织增生,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡,但程度均较病理模型组有明显减轻。2.柔肝化纤颗粒对SOD、GSH-Px、MDA含量的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的MDA含2量显着升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组MDA含量均有不同程度降低（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的SOD、GSH-Px显着降低（P<0.05）;与模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组明显升高（P<0.05）。3.柔肝化纤颗粒对血清ROS的影响与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量明显升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量均降低（P<0.05）。4.柔肝化纤颗粒对α-SMA m RNA、E-Cadherin m RNA、PKCαm RNA、Nrf2mRNA、HO-1 m RNA、NQO1 m RNA、Collagen I m RNA、Collagen III m RNA表达的影响1与正常组相比,病理模型组的PKCαm RNA相对表达量下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的NQO1 m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。?与正常组相比,病理模型组的Collagen I m RNA相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen I m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组Collagen III m RNA相对表达量显着升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen III m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。5.柔肝化纤颗粒对α-SMA、E-Cadherin、HO-1、NQO1、PKCα、Nrf2、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组Nrf2蛋白表达下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组Nrf2蛋白表达无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2蛋白表达明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、柔肝化纤颗粒组的HO-1蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组HO-1蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组的HO-1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒升高不明显（P>0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的α-SMA蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组的E-Cadherin蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组的Collagen I蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组的Collagen III蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。结论:柔肝化纤颗粒可改善CCl4诱导的大鼠的肝纤维化程度,显着降低血清中ROS、MDA含量,升高血清中SOD、GSH-Px的含量,提示柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠具有一定的抗氧化应激作用。柔肝化纤颗粒通过对PKCα的激活,促进Nrf2发生核转移,抑制ROS信号通路的表达以抗氧化应激反应,下调α-SMA、E-cadherin的表达以抑制HSCs活化,减少Collagen I、Collagen III分泌,减少ECM在肝脏中的沉积,从而实现逆转肝纤维化进程。
黄家程[6]（2021）在《化肝纤方联合恩替卡韦治疗乙型肝炎相关肝纤维化的临床研究》文中进行了进一步梳理目的:观察化肝纤方联合恩替卡韦治疗乙型肝炎相关肝纤维化的临床疗效,并分析其作用机制。方法:选取符合纳入标准患者60例,随机分为对照组和观察组各30例,观察组予化肝纤方和恩替卡韦治疗,对照组予安络化纤丸和恩替卡韦治疗。连续用药24周。观察治疗后肝功能（ALT、AST）、血清肝纤维化指标（HA、PⅢNP、CⅣ、LN）、APRI、HBV-DNA定量、肝脏硬度值（LSM）、腹部B超及临床症状变化,并进行安全性评价。结果:1、对肝功能的疗效:治疗后第12周、24周时,对照组和观察组ALT、AST均明显下降,组内差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组ALT、AST下降情况较对照组更显着,组间对比差异有统计学意义（P<0.05）。2、对HBV DNA阴转率的疗效:治疗24周后,两组HBV DNA阴性人数较前增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组和对照组阴转率差异无统计学意义（P>0.05）。3、对肝纤维化指标的疗效:观察组和对照组治疗第12周、第24周后HA、LN、PIIINP、CIV、LSM均较治疗前下降,且观察组较对照组下降更明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗24周后APRI较前显着下降,观察组下降更明显,差异有统计学意义（P<0.05）。4、对血流动力学的改变:观察组和对照组治疗24周后,两组门静脉主干内径、脾静脉内径、门脉血流速度较前无明显改变,组间和组内差异均没有统计学意义（P>0.05）。5、对中医综合症状疗效:治疗后观察组各症状积分、中医证候总积分较前下降,差异有统计学意义（P<0.05）。对照组肝区疼痛、脘腹胀闷、神疲乏力、纳寐欠佳、口干咽燥、恶心欲呕、大便异常各症状积分及中医证候总积分较前下降,差异有统计学意义（P<0.05）,但对照组潮热盗汗症状较前无明显改变（P>0.05）。观察组肝区疼痛、脘腹胀闷、口干咽燥、潮热盗汗症状改善比对照组更显着（P<0.05）。观察组总有效率明显高于对照组的总有效率（P<0.05）。结论:1、化肝纤方联合恩替卡韦治疗乙型肝炎相关肝纤维化总有效率高,可明显改善患者肝功能,抑制HBV DNA复制,显着降低血清肝纤维化指标、LSM、APRI水平,能够有效减轻肝损伤,改善患者肝脏纤维化程度,延缓或阻止肝纤维化进程。2、化肝纤方能够显着改善患者临床症状,对瘀血阻络、气阴两虚证之肝区疼痛、脘腹胀闷、口干咽燥、潮热盗汗疗效显着。
张嘉鑫[7]（2021）在《基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究》文中研究指明背景:肝硬化（Hepatic cirrhosis,HC）为肝脏受各种损伤因素侵袭,出现以肝纤维化、假小叶为特点的疾病,由乙肝病毒、丙肝病毒、酒精等一种或多种病因引起。5年生存率为14-35%,已成为全球成人死亡率第14高的病因。目前的治疗主要集中在病因与并发症防治方面,肝硬化本身能否被逆转一直存在争议。国内外学者认为,肝硬化实现逆转必然涉及以下三方面环节:细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解,肝细胞再生及肝小叶结构重建。其中,ECM降解为重要前提。近年研究提示,弹性蛋白合成、降解及其交联阻碍了 ECM降解,进而影响逆转过程。弹性蛋白是由肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分泌的,为ECM重要组分。其在正常肝脏中也存在,但含量极低,在肝硬化阶段,沉积迅速。目前,中药单体、复方研究多集中于抗纤维化领域,对早期肝硬化关注较少,需要更多基础研究及高质量的临床试验进一步证实中药疗效优势,并对其相关机制进行深入挖掘。中药复方具有多层次、多靶点的先天优势,但现有研究多聚焦于抑制HSCs活化、促进胶原降解或抗肝窦毛细血管化等方向,尚未对中医药潜在的调控弹性蛋白合成及降解的相关机制进行探索。目的:基于益肝消积方对弹性蛋白合成及降解的调控作用,探索在四氯化碳（CCl4）诱导的肝脏发生损伤形成早期肝硬化病变后,该复方干预早期肝硬化的效果及其可能的机制,以期为益肝消积方进一步成果转化提供理论支撑,同时亦为其它防治早期肝硬化药物的研发提供方向。方法:通过给予SPF级雄性Sprague Dawley大鼠（200±10g）1ml/kg腹腔内注射50%CCl4和橄榄油混合液,2次/周,共6周,构建早期肝硬化模型。7周始,予益肝消积方、阳性对照药（安络化纤丸）,1ml/100g剂量灌胃。空白对照、模型对照组予等剂量蒸馏水灌胃,日1次,持续6周。用生化法检测ALT、AST评估肝功能;行组织病理学染色（HE染色、天狼猩红染色及Masson染色）评估早期肝硬化病变进展、检测肝脏胶原沉积;用弹性纤维染色评估肝脏的弹性蛋白沉积;免疫组织化学染色、免疫荧光染色观察肝组织中TGF-β1、CD68、CD80、CD163和α-SMA表达情况;用蛋白免疫印迹（Western blot,WB）分析以及实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-βR-Ⅱ、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4、Smad7、Sp1、TNF-α、Ras、MEK1/2、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1的蛋白水平及bFGF、弹性蛋白（Elastin）的mRNA水平变化,进而对益肝消积方干预早期肝硬化的作用及其相关机制进行初步探索。结果:1.模型制备:予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周。造模6周后,组织病理染色发现,模型组大鼠肝脏出现大量纤维增生,汇管区增宽,形成假小叶,说明模型制备成功。2.一般情况:益肝消积方治疗组及阳性对照安络化纤丸组大鼠毛色、精神状态、进食量等方面均优于模型组。体重上,治疗组大鼠体重均明显高于模型组（P<0.01）;体重增长趋势上,益肝消积方组优于安络化纤丸组。3.肝功能:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST含量升高显着（P<0.01）。益肝消积方和阳性对照组（安络化纤丸）较模型组显着下降（P<0.05或P<0.01）。与安络化纤丸相比,益肝消积方在改善ALT方面疗效较优。4.肝组织病理学表现:从肝脏外观看,模型组大鼠颜色变暗,体积缩小,表面粗糙,边缘较钝,质地较硬韧,部分肝脏在剥离时与胸膜腔其他组织相粘连,难以剥离。益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝体积缩小不明显,表面粗糙不明显,质地较柔韧,未发现与胸腔其他组织粘连,较易剥离。此外,通过组织学染色（HE染色、Masson染色、天狼猩红染色）发现,与模型组大鼠相比,益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝脏炎性细胞浸润程度减轻,病变范围减小,汇管区及周围纤维增生程度减轻,假小叶数量明显减少,且胶原纤维等细胞外基质成分沉积减少（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方抑制胶原沉积的效果较好。说明益肝消积方能够有效抑制炎细胞浸润,减少胶原纤维过度沉积,从而发挥干预早期肝硬化的作用。5.弹性纤维染色结果:为观测弹性纤维变化,我们对其进行了特殊染色。实验发现,在早期肝硬化阶段,模型组弹性纤维含量增多迅速,显着高于空白对照组（P<0.01）。益肝消积方、安络化纤丸治疗组与模型组相比,弹性纤维含量显着减少（P<0.01）,且益肝消积方效果较明显。6.免疫组化、免疫荧光染色结果:与空白对照组相比,模型组TGF-β1、α-SMA、CD68、CD80、CD163阳性表达区域明显增多。与模型组相比,益肝消积方、安络化纤丸组阳性区域明显减少。7.qRT-PCR结果:模型组与空白对照组相比,ElastinmRNA表达量显着升高（P<0.01）。与模型组相比,益肝消积方治疗组ElastinmRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方减少ElastinmRNA表达更显着;模型组bFGF mRNA较正常组升高显着（P<0.01）。对比模型组,益肝消积方治疗组bFGF mRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方下调bFGF mRNA表达更显着。8.Western blot 结果:与空白对照组相比,模型组 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显升高（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2 蛋白表达含量明显下降（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,益肝消积方治疗组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显降低（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2蛋白表达含量明显上升（P<0.05或P<0.01）。结论:1.予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周,共6周,可成功制备早期肝硬化大鼠模型。予益肝消积方干预后,可改善早期肝硬化大鼠体重、肝功能;有效抑制早期肝硬化大鼠肝脏炎性细胞浸润,肝细胞变性、坏死,胶原纤维（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ）、弹性纤维等ECM沉积,改善病变程度。2.益肝消积方可抑制α-SMA表达,下调CD68、CD80、CD163表达量,抑制CCL2-CCR2通路,进而具有抑制HSCs激活,抑制单核/巨噬细胞浸润,及向M2型巨噬细胞极化,阻止单核/巨噬细胞向损伤肝组织部位迁移,减少Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和Elastin含量,发挥干预早期肝硬化的作用。3.益肝消积方能通过 TGF-β1/Smads、TGF-β1/Ras/ERK 和 bFGF、TNF-α/MEK/ERK信号转导通路抑制胶原纤维、弹性纤维等ECM合成,发挥干预早期肝硬化的作用。4.益肝消积方可通过调节MMPs/TIMPs酶系,促进胶原纤维、弹性纤维等ECM降解,达到干预早期肝硬化的作用。
谢寿珍[8]（2021）在《Fibor-Touch评估减重对青海地区CHB和NAFLD肝纤维化逆转的临床价值》文中进行了进一步梳理目的:本研究借助肝脏瞬时弹性检测无创诊断肝纤维化及肝脏脂肪变程度的特点,评价有效的体质量干预对青海地区CHB和NAFLD患者肝纤维化及脂肪变进程的减缓作用,以此来指导此类患者通过降低体质量来延缓病情的进一步发展,降低患者发生严重后果的机率并改善预后。方法:收集符合纳排标准的患者共160例,A组（慢性乙型病毒性肝炎）病例52例、B组（非酒精性脂肪性肝病）病例58例,C组（慢性乙肝合并非酒精性脂肪性肝病）病例50例。记录干预前患者的肝硬度值LSM,脂肪衰减系数值CAP,肝功能及血脂指标等一般资料,由青海省人民医院营养科及课题组成员对三组病例开展为期6个月的体质量干预性指导,根据患者的实际情况制定减重方案,干预结束后复测上述各项指标,明确有效的体质量干预（BMI下降≥2 kg/m2）是否能减缓三组病例的肝纤维化及肝脏脂肪变程度,以及对肝功能、血脂指标的影响。结果:1、A、B、C三组病例经过6个月的体质量干预性后,干预有效组（BMI下降≥2 kg/m2）的脂肪衰减系数CAP较干预无效组（BMI下降<2 kg/m2）均有所下降（t=3.088,P=0.003;t=2.729,P=0.08;t=2.502,P=0.016）（P<0.05）,差异具有统计学意义。2、B组病例经过6个月的体质量干预后,干预有效组的肝纤维化指标LSM较干预无效组有所下降（t=3.180,P=0.002）（P<0.05）,同时B组患者的肝功能指标ALT较干预前有所改善（t=3.532,P=0.001）（P<0.05）,差异均具有统计学意义。3、A、B、C三组病例经过6个月的体质量干预性后,干预有效组的血脂指标较干预无效组均有不同程度下降,尤其TG、LDL-D的改善较为明显,且均具有统计学意义。结论:本研究基于Fibor-Touch检测技术证实了通过有效的减重干预能有效缓解单纯NAFLD患者以及NAFLD合并CHB患者肝脏脂肪变的程度,尤其是对没有合并CHB的NAFLD患者效果更为显着,在此基础上还能控制肝纤维化进一步发展,同时能改善肝功能指标ALT。另外还能改善这三类患者的血脂指标,尤其TG、LDL-D的改善较为明显。
李文聪[9]（2021）在《益气活血方促进肝再生的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理肝再生（liver regeneration,LR）是指在多种物理、化学及生物因素造成肝脏损伤后,肝脏细胞（尤其肝细胞）迅速被激活,通过脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）合成和有丝分裂增殖,重建肝脏组织结构,恢复肝功能的生理过程,该过程包括多种细胞增殖,是由多条通路、多种因素共同参与调控的复杂且精确的过程。目前,小鼠或大鼠部分肝切除术（partial hepatectomy,PH）是构建肝再生动物模型最常用的方法,此外,胆道结扎模型、化学所致肝毒性损伤或药理模型以及转基因动物模型等也广泛应用。临床上,PH已成为多数肝脏肿瘤患者的根治性方案,然而,肝脏肿瘤患者常常合并不同病因的肝炎、肝纤维化甚至肝硬化,尤其肝硬化患者,肝再生能力明显下降,增加了PH术后肝衰竭的发病率及病死率。因此,肝再生能力的提高将是PH术后患者良好治疗的基础,亦是其术后能够生存的关键。已有研究发现,胶原降解、肝细胞再生和血管重建是肝纤维化逆转的三大机制,可见肝纤维化的逆转也有赖于肝再生功能的提高。我国传统中医药在治疗肝纤维化方面取得了巨大的成果,多项研究已显示,丹参/丹参素、赤芍、扶正化瘀复方等中草药/中成药具有促进肝细胞增殖及再生的作用。益气活血方（Yiqi Huoxue recipe,YQHX）由丹参、赤芍、黄芪等中草药组成,既往研究发现,该方可调节自噬,抑制肝星状细胞的活化和胶原沉积,逆转四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导的大鼠肝纤维化。但尚缺乏其对肝再生影响的观察和研究。基于上述背景,本研究通过慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化患者应用益气活血方治疗前后肝穿病理结果的对比分析,验证益气活血方促进肝再生、逆转肝纤维化的作用,并通过2/3PH术构建大鼠肝再生模型,以益气活血方对正常大鼠2/3PH术后肝再生的影响及其可能作用机制为研究切入点,以扶正化瘀复方冲剂（Fuzheng Huayu decoction,FZHY）作为阳性对照药物,运用病理形态学、分子生物学等方法动态分析大鼠2/3PH术后不同时间节点肝脏组织学、肝再生相关信号通路中细胞因子的变化,分析益气活血方对大鼠肝再生的作用。同时,以CCl4腹腔注射构建肝硬化大鼠模型,研究益气活血方在肝硬化模型中对肝再生的作用,为该方剂的临床应用提供理论依据。第一部分益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的临床研究目的:验证益气活血方促进肝再生、改善肝纤维化的临床效果。方法:选择慢性乙型病毒性肝炎纤维化（F≥2）患者31例,分为恩替卡韦治疗组（ETV,n=18）、恩替卡韦联合益气活血方治疗组（YQHX+ETV,n=13例）,疗程24～52周。采用HE、Masson染色评定肝脏的炎症及纤维化程度;应用免疫组织化学染色方法测定肝脏细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、ki67、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的蛋白表达水平。分析治疗前后肝脏生化学、肝纤维化逆转及肝再生情况。结果:YOHX+ETV和ETV治疗患者血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷氨酰转肽酶水平显着降低（P<0.05）,白蛋白水平显着增高（P<0.05）。YQHX+ETV治疗后纤维化分期显着下降（P<0.05）,肝组织Cyclin D1、ki67和PCNA的表达显着高于治疗前的水平（P<0.05）;ETV治疗患者肝组织Cyclin D1表达显着升高（P<0.05）,ki67的表达显着下降（P<0.05）,但肝纤维化无显着改善。小结:益气活血方联合ETV治疗可显着提高慢性乙型肝炎肝纤维化患者肝再生能力,并可逆转纤维化。第二部分益气活血方对大鼠部分肝切除术后肝再生的作用研究目的:明确益气活血方对大鼠肝再生的影响。方法:以2/3 PH术构建Wistar大鼠肝再生模型。选取SPF级雄性Wistar大鼠48只,随机分为4组:假手术组（Sham）、2/3肝部分切除术组（PH）、益气活血方+2/3肝部分切除术组（YQHX+PH）、扶正化瘀复方冲剂+2/3肝部分切除术组（FZHY+PH）。PH术前3天,Sham组和PH组大鼠给予0.90%氯化钠溶液（0.50ml/100g）灌胃,YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠分别YQHX（0.50ml/100g）和FZHY（0.50ml/100g）灌胃,每日1次。各组分别于PH术后24h、72h、96h、168h处死大鼠,切除全部肝组织称湿重,计算肝脏再生速度。应用免疫组织化学染色测定肝组织Cyclin D1的表达水平。结果:1.益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝再生率PH术后,各组间大鼠肝再生率随时间的延长均呈递增趋势,YQHX+PH和FZHY+PH组的总体趋势较PH组明显增加,但两中药干预组组间比较均无显着差异（P>0.05）。PH术后24h,YQHX+PH组（25.41±4.03%）和FZHY+PH组（30.86±0.11%）大鼠肝再生率均显着高于PH组（14.20±2.02%,P<0.05）。PH术后96h,YQHX+PH组大鼠肝再生率较PH组显着升高（56.97±7.69%vs.38.96±4.21%,P<0.05）。PH术后168h,FZHY+PH组大鼠肝再生率较PH组显着升高（65.80±3.37%vs.53.02±4.32%,P<0.05）。2.益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝脏Cyclin D1的表达PH术后24h、72h、96h和168h,PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达均显着高于Sham组（P<0.05）。其中PH术后24h,YQHX+PH和FZHY+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达显着升高,但与PH组比较无统计学差异（P>0.05）。PH术后72h和96h,YQHX+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达高于PH组,但无统计学差异（P>0.05）,FZHY+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达显着高于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）。术后168h,各组大鼠肝脏Cyclin D1的表达均较之前的时间节点下降,YQHX+PH和FZHY+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达较Sham组升高,但与PH组比较无统计学差异（P>0.05）。小结:益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝再生率及肝组织Cyclin D1的表达水平,促进肝脏细胞分裂、增殖,迅速恢复原有的体积和功能。第三部分益气活血方促进大鼠部分肝切除术后肝再生的分子机制研究目的:探讨益气活血方促进PH术后大鼠肝再生的相关机制。方法:动物模型的建立及分组处理同第二部分。应用免疫组织化学染色方法测定肝脏c-jun的表达水平;采用western blot方法测定肝组织c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）1/2、p-JNK1/2、c-jun、p-c-jun、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated x-protein,Bax）的蛋白表达水平;采用PCR方法测定肝组织JNK1、JNK2、c-jun、Bcl-2、Bax的m RNA表达水平。结果:1.PH术后不同时间节点各组大鼠肝脏c-jun表达量的比较PH术后24h、72h、96h,PH组大鼠肝脏c-jun的表达显着高于Sham组（P<0.05）,而PH术后168h,PH组大鼠肝脏c-jun表达量与Sham组比较无显着差异（P>0.05）。PH术后24h,与PH组比较,YQHX+PH组大鼠肝脏c-jun的表达下降,但无统计学差异（P>0.05）,FZHY+PH组大鼠肝脏c-jun的表达量显着下降（P<0.05）。PH术后72h,YQHX+PH组大鼠肝脏c-jun的表达量显着低于PH组和FZHY+PH组（P<0.05）。PH术后96h,YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠肝脏c-jun的表达显着高于PH组（P<0.05）,且YQHX+PH组大鼠肝脏c-jun的表达量较FZHY+PH组显着增高（P<0.05）。PH术后168h,各组大鼠肝脏c-jun的表达量均减低,FZHY+PH组大鼠肝脏c-jun表达量较PH组和YQHX+PH组显着升高（P<0.05）。2.PH术后不同时间节点各组大鼠肝脏JNK通路相关因子的表达在PH术后不同时间节点,YQHX及FZHY干预对JNK1、JNK2及c-jun的肝脏m RNA表达水平无显着影响。经JNK1/2和c-jun蛋白水平的检测,发现磷酸化指标在肝再生过程中起到了主导作用。在PH术后24h、72h及168h,PH组大鼠肝组织p-JNK1/2蛋白表达水平明显高于Sham组（P<0.05）,而YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠肝组织p-JNK1/2蛋白表达量显着高于PH组（P<0.05）,FZHY+PH组的表达量显着高于YQHX+PH组（P<0.05）。在PH术后96h,PH组大鼠肝组织p-JNK1/2蛋白表达水平明显高于Sham组（P<0.05）,FZHY+PH组表达量显着高于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）,而YQHX+PH组与PH组比较无明显差异（P>0.05）。在p-c-jun肝组织蛋白表达水平方面,结果显示:在PH术后72h,PH组大鼠肝组织p-c-jun蛋白水平显着高于Sham组（P<0.05）,YQHX+PH组和FZHY+PH组表达量显着高于PH组（P<0.05）,其中FZHY+PH组表达量更高,但与YQHX+PH组比较无统计学意义（P>0.05）。在PH术后24h,各组p-c-jun的表达趋势与PH术后72h相同,但各组间差异均无统计学意义（P>0.05）。在PH术后96h和168h,PH组大鼠肝组织p-c-jun蛋白表达量显着高于Sham组（P<0.05）,FZHY+PH组表达量显着高于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）,而YQHX+PH组与PH组比较无明显差异（P>0.05）。3.PH术后不同时间节点各组大鼠肝脏凋亡通路相关因子的表达在PH术后24h、72h、96h和168h,PH组大鼠肝脏Bax蛋白表达水平均显着低于Sham组（P<0.05）,FZHY+PH组大鼠肝脏Bax蛋白表达水平均显着低于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）。值得注意的是,在PH术后24h和96h,YQHX+PH组大鼠肝脏Bax蛋白表达水平显着低于PH组（P<0.05）,而在PH术后72h和168h,与PH组比较无明显差异（P>0.05）。各组大鼠肝脏Bax的m RNA表达趋势与蛋白表达基本相同。在PH术后24h、72h、96h和168h,PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平均显着高于Sham组（P<0.05）。在PH术后24h、72h、96h,YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平均显着高于PH组（P<0.05）;在PH术后168h,仅FZHY+PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平显着高于PH组（P<0.05）。除了PH术后24h,YQHX+PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平显着高于FXHY+PH（P<0.05）外,其余各时间点,均显着低于FZHY+PH组（P<0.05）。Bcl-2的m RNA表达趋势与蛋白表达趋势相近。小结:1.益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝组织p-JNK1/2、p-c-jun的蛋白表达水平,通过JNK通路促进肝再生;2.益气活血方可显着降低PH术后大鼠肝组织Bax的表达,同时显着升高Bcl-2的表达,进而抑制肝细胞凋亡的发生,促进肝再生。第四部分益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的作用及机制研究目的:探讨益气活血方对肝硬化中肝再生的影响及机制。方法:选取雄性SPF级Wistar大鼠36只,随机分为4组:（1）对照组（Control）:橄榄油腹腔注射（0.20ml/100g）,2次/周,同时予1ml/100g生理盐水灌胃,1次/日;（2）模型组（CCl4）:30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射（0.20ml/100g）,2次/周,同时予1ml/100g生理盐水灌胃,1次/日;（3）益气活血方干预组（CCl4+YQHX）:30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射加益气活血方（3.40g/10ml/kg·d）冲剂灌胃;（4）扶正化瘀方干预组（CCl4+FZHY）:30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射加扶正化瘀（0.46g/10ml/kg·d）冲剂灌胃。喂养8周后,各组大鼠在10%水合氯醛麻醉下被处死,留取血清,测定血清ALT、AST水平;采用HE、Masson染色评定肝脏的炎症及纤维化程度;采用western blot方法测定肝组织Cyclin D1的蛋白表达水平;应用免疫组织化学染色方法测定肝脏细胞角蛋白19（cytokeratin 19,CK19）、Cyclin D1、ki67、PCNA的表达水平。结果:1.益气活血方显着降低肝硬化大鼠血清转氨酶水平模型组大鼠血清ALT（80.14±35.73U/L vs.41.43±9.76U/L）和AST（258.40±90.80U/L vs.114.33±15.47U/L）水平显着高于对照组（P<0.05）。益气活血方与扶正化瘀复方冲剂的干预可显着改善CCl4造成的ALT（55.67±17.91 U/L,63.20±27.60 U/L）和AST（138.50±47.31 U/L,178.50±42.24 U/L）升高,其中AST水平较CCl4组比较均显着下降（P<0.05）,但两种中药复方干预组比较均无统计学意义（P>0.05）。2.益气活血方可显着改善实验大鼠肝纤维化程度对照组大鼠肝组织结构完整,肝细胞排列整齐;模型组大鼠肝小叶结构破坏,炎性细胞增多,部分肝细胞脂肪变性;纤维组织增生,形成大小不等的假小叶;CCl4+YQHX组大鼠肝组织纤维增生,肝小叶被破坏,可见小灶状炎性浸润;CCl4+FZHY组正常肝小叶结构破坏,分割成大小不等的假小叶。但总体来看,益气活血方和扶正化瘀复方冲剂干预组纤维间隔较模型组纤细,假小叶体积明显较模型组增大,可见益气活血方可显着改善CCl4诱导的肝纤维化程度,并有效促进肝脏再生。3.益气活血方显着上调肝硬化大鼠肝再生基因的表达在肝硬化模型组发现CK19标记阳性的Hering管,即为胆管反应,主要集中在汇管区。而益气活血方及扶正化瘀复方冲剂干预组并未显着上调胆管反应。Western blot结果显示,CCl4组大鼠肝组织Cyclin D1的蛋白表达显着低于对照组（P<0.05）,CCl4+YQHX组大鼠肝组织Cyclin D1的蛋白表达水平显着高于CCl4组及CCl4+FZHY组（P<0.05）。进一步通过免疫组织化学方法测定大鼠肝脏Cyclin D1的表达水平,结果与western blot的趋势基本相同。此外,免疫组织化学染色结果显示,CCl4组大鼠肝脏ki67及PCNA的表达水平显着低于对照组（P<0.05）,YQHX和FZHY干预组较CCl4组显着上调了大鼠肝脏ki67及PCNA的表达（P<0.05）,其中CCl4+YQHX组显着高于CCl4+FZHY组（P<0.05）。小结:1.益气活血方可显着改善CCl4诱导的肝组织炎症及肝纤维化程度;2.益气活血方可显着提高肝组织Cyclin D1、ki67、PCNA的表达水平,促进肝硬化大鼠的肝细胞再生,起到改善肝脏炎症、纤维化的作用。结论:1.临床应用益气活血方可显着改善慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化的纤维化程度,加强肝细胞再生,为临床中终末期肝病的治疗提供了理论依据;2.通过大鼠2/3PH术构建肝再生模型,及CCl4腹腔注射诱导的肝硬化模型,均证实益气活血方具有显着促进肝细胞再生的作用,并显着改善肝硬化的肝再生能力,逆转肝纤维化;3.益气活血方有望成为肝硬化肝再生方面的治疗药物,其具体机制仍有待进一步的验证。
尤鸿美[10]（2021）在《甲基化修饰的miR-455-3p/HDAC2在肝纤维化形成和逆转中的功能和机制研究》文中指出肝纤维化是由多种慢性刺激（如酒精滥用,自身免疫性疾病,病毒性感染,代谢性疾病,高脂饮食等）持续作用在肝脏而引发的一种损伤后修复反应。当该刺激长期存在时,会导致包括一型胶原（COL1α1）在内的大量细胞外基质堆积在肝脏中,使肝脏正常生理结构紊乱。一旦治疗不及时,肝纤维化则可能发展至肝硬化甚至肝癌。而作为合成细胞外基质的主力军,活化的肝星状细胞则成为肝纤维化治疗的重要靶点。大量研究已然表明,抑制肝星状细胞的活化增殖,以及促进其凋亡是当前治疗肝纤维化的重要方案。我们课题组前期研究发现组蛋白脱乙酰基酶（Histone deacytylases,HDACs）,尤其是HDAC2在减轻肝脏纤维化进展中有着不可替代的重要作用,但其具体的上游调控机制尚不清楚。在当前研究中,我们利用Target Scan网站对HDAC2的潜在上游靶标进行预测,在多个被预测的上游靶标中,mi R-455-3p吸引了我们的注意,因此我们对其展开了研究。首先双重荧光素酶报告的结果表明,mi R-455-3p可以与HDAC2 m RNA的3’UTR结合。此外,我们证明了mi R-455-3p在来自肝硬化患者和肝纤维化小鼠的肝脏组织中表达下降,并且其在肝纤维化小鼠中提取分离出的原代肝星状细胞和经转化生长因子β（TGF-β）刺激活化的LX-2细胞内表达也同样被下调。相反,mi R-455-3p在逆转期肝纤维化小鼠组织和从逆转期肝纤维化小鼠中提取分离的原代肝星状细胞中表达上调,在脂肪细胞诱导分化剂（MDI）诱导逆转的LX-2细胞中也呈现高表达趋势。此外为了探究mi R-455-3p的功能,我们利用mi R-455-3p mimics来过表达活化LX-2细胞中mi R-455-3p,并利用RT-q PCR来检测转染效率,通过western blotting,RT-PCR,流式,CCK-8等方法来检测过表达mi R-455-3p对活化LX-2的功能及状态的影响。结果表明,mi R-455-3p的过表达促进LX-2细胞凋亡,并减少了活化LX-2细胞中的纤维化标记蛋白α-SMA,COL1α1和细胞增殖相关蛋白C-myc,cyclin D1表达含量。而当我们在失活的LX-2细胞中利用mi R-455-3p inhibitor抑制mi R-455-3p表达时,失活态的LX-2细胞开始向活化态转变,并伴随有肝星状细胞活化标记蛋白α-SMA,COL1α1表达含量的上升以及细胞增殖相关蛋白C-myc,cyclin D1含量的上调。有趣的是,当我们向转染了mi R-455-3p mimics的活化态LX-2细胞中共转染HDAC2过表达质粒时,mi R-455-3p的功能会被高表达的HDAC2部分抑制。同样地,当向抑制了mi R-455-3p的失活态LX-2细胞中同时抑制HDAC2的表达时,低表达mi R-455-3p的效应也会被HDAC2 si RNA部分阻断。大量文献表明,表观遗传学修饰在肝纤维化疾病进展以及肝星状细胞的活化过程中起着重要的作用,DNA甲基化是表观遗传学修饰的方式之一。Mi RNAs在表观遗传中可以作为调控者,通过靶向DNA甲基化转移酶（DNMTs）抑制其表达从而影响下游基因的含量及活性,同时mi RNAs也可以作为表观遗传学修饰中的被调控者,其细胞表达水平与表观遗传密不可分。我们通过软件预测了mi R-455-3p启动子区域可能会发生甲基化的Cp G岛位点,并通过MSP和BSP实验检测了LX-2细胞中mi R-455-3p启动子的甲基化水平,结果表明与静息态LX-2细胞相比,在经TGF-β处理的LX-2细胞中,mi R-455-3p启动子Cp G岛的甲基化水平升高。并且我们发现当在活化态LX-2细胞中沉默DNMT1和DNMT3b时,原本下调的mi R-455-3p的表达水平则会随之相应地升高。Ch IP的实验结果表明mi R-455-3p启动子甲基化是由DNMT1和DNMT3b介导。以上研究结果表明,mi R-455-3p/HDAC2轴在调节肝星状细胞的活化,增殖以及凋亡过程中扮演不可或缺的角色作用,并且mi R-455-3p的表达水平也受到了表观遗传的调控。因此mi R-455-3p/HDAC2可能可以作为临床治疗肝纤维化的新型潜在治疗靶标。
二、肝纤维化逆转的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝纤维化逆转的研究进展（论文提纲范文）
（1）芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察及其抗肝纤维化血管新生的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肝纤维化/肝硬化诊断技术研究进展 |
| 1. 肝穿活检病理学 |
| 2. 影像学检查 |
| 3. 血清学 |
| 4. 肝静脉压力梯度 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝窦毛细血管化与肝纤维化研究进展 |
| 1. 肝脏的结构 |
| 2. 肝窦内皮的结构与功能 |
| 3. 肝窦内皮毛细血管化与肝纤维化 |
| 4. 肝窦内皮毛细血管化的调控机制 |
| 5. 肝窦内皮毛细血管化治疗 |
| 6. 展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察 |
| 1. 资料与方法 |
| 2. 统计方法 |
| 3. 试验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 芪术颗粒对肝窦内皮细胞毛细血管化的影响及其机制研究 |
| 实验一 芪术颗粒对大鼠肝纤维化的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 实验二 芪术颗粒对肝纤维化过程中血管新生的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 实验三 芪术颗粒对肝窦内皮细胞毛细血管化的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 实验四 芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新性 |
| 不足 |
| 展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 表1 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝纤维化的研究现状 |
| 1.1.1 化学合成药物抗肝纤维化研究进展 |
| 1.1.2 中药抗肝纤维化研究进展 |
| 1.2 肝纤维化的诱发因素 |
| 1.3 肝纤维化的发展机理 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号靶点 |
| 1.4.1 TGF-β/smads调控肝纤维化 |
| 1.4.2 PI3K/Akt/mTOR调控肝纤维化 |
| 1.4.3 TLR4/My D88/NF-kB调控肝纤维化 |
| 1.4.4 FXR/SHP/LXR调控肝纤维化 |
| 1.5 本研究的目的 |
| 第二章 芝麻素通过介导 FXR/SHP 信号交互调控炎症减轻肝纤维化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养 |
| 2.3.2 血清AST/ALT的测定 |
| 2.3.3 制备肝脏切片 |
| 2.3.4 H&E染色 |
| 2.3.5 Masson染色 |
| 2.3.6 Sirius Red染色 |
| 2.3.7 IHC染色 |
| 2.3.8 组织免疫荧光 |
| 2.3.9 实验细胞的培养 |
| 2.3.10 细胞生存率检测 |
| 2.3.11 细胞荧光染色检测 |
| 2.3.12 细胞基因沉默实验 |
| 2.3.13 蛋白印迹实验 |
| 2.3.14 qRT-PCR检测 |
| 2.3.15 统计学处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SES改善血清生化指标升高及组织病理学变化 |
| 2.4.2 SES改善小鼠肝脏胶原沉积 |
| 2.4.3 SES增强FXR/SHP信号干预肝纤维化 |
| 2.4.4 SES抑制肝纤维化中炎症细胞因子的产生 |
| 2.4.5 SES抑制TGF-β诱导的HSCs中纤维化标志蛋白的表达 |
| 2.4.6 SES抑制HSCs中炎症细胞因子的产生 |
| 2.4.7 SES调控FXR介导的SHP信号抑制HSCs的激活 |
| 2.4.8 SES通过siFXR介导SHP减少HSCs的活化 |
| 2.4.9 SES通过调控si SHP介导FXR减少HSCs的活化 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 芝麻酚靶向FXR/LXR信号交互参与巨噬细胞和肝星状细胞串扰改善肝纤维化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物模型建立 |
| 3.3.2 血清AST/ALT测定 |
| 3.3.3 制备石蜡切片 |
| 3.3.4 HE染色 |
| 3.3.5 Masson染色 |
| 3.3.6 Sirius Red染色 |
| 3.3.7 组织免疫荧光染色 |
| 3.3.8 实验细胞培养 |
| 3.3.9 细胞生存率检测 |
| 3.3.10 细胞荧光染色检测 |
| 3.3.11 细胞基因沉默实验 |
| 3.3.12 蛋白印迹实验 |
| 3.3.13 qRT-PCR检测 |
| 3.3.14 RT-PCR检测 |
| 3.3.15 统计学处理 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DER改善血清生化指标及组织病理学的改变 |
| 3.4.2 DER改善肝纤维化中胶原累积 |
| 3.4.3 DER抑制TAA诱导的小鼠肝脏炎症 |
| 3.4.4 DER参与FXR/LXR信号介导的自噬改善肝纤维化 |
| 3.4.5 DER改善TAA或 RA诱导的血清生化指标及病理学的改变 |
| 3.4.6 DER抑制肝脏自噬 |
| 3.4.7 DER抑制TAA诱导的炎症细胞因子的产生 |
| 3.4.8 DER抑制活化HSCs中纤维化标志蛋白的表达 |
| 3.4.9 DER减少活化HSCs中炎症细胞因子的产生 |
| 3.4.10 DER调控FXR/LXR和自噬信号逆转HSCs的激活 |
| 3.4.11 DER作用同3-MA抑制HSCs的自噬及炎症因子的表达 |
| 3.4.12 DER抑制巨噬细胞的上清液激活的肝星状细胞自噬 |
| 3.4.13 DER抑制巨噬细胞的上清液激活的肝星状细胞炎症的表达 |
| 3.4.14 DER通过siATG7 抑制自噬减少肝星状细胞的激活 |
| 3.4.15 DER调节FXR/LXRα及炎症因子在基因水平上的表达 |
| 3.4.16 DER激活FXR抑制肝星状细胞的激活和自噬 |
| 3.4.17 DER激活LXRs抑制肝星状细胞的激活和自噬 |
| 3.4.18 FXR/LXR参与巨噬细胞和肝星状细胞间的串扰 |
| 3.4.19 DER靶向FXR/LXR交互参与细胞串扰抑制肝星状细胞激活 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 发表论文 |
| 附录2 研究生期间获奖情况 |
（3）基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词语注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肝纤维化的形成 |
| 1.2 肝纤维化的诱因 |
| 1.2.1 酒精性肝损伤 |
| 1.2.2 非酒精性脂肪性肝损伤 |
| 1.2.3 病毒性肝炎 |
| 1.3 多种病理机制参与肝纤维化进程 |
| 1.3.1 肝内巨噬细胞活化影响肝纤维化进程 |
| 1.3.2 氧化应激加速肝纤维化进程 |
| 1.3.3 肝脏炎症加速肝纤维化进程 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号转导途径 |
| 1.4.1 FXR在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.2 LXRs在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.3 TGF-β信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.4 P2X7r-NLRP3信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.5 PI3K-Akt信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.5 .肝纤维化治疗药物研究 |
| 1.5.1 中药治疗肝纤维化 |
| 1.5.2 西药治疗肝纤维化 |
| 1.6 人参的肝保护作用 |
| 1.7 本课题研究思路 |
| 第二章 人参皂苷25-OCH_3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 动物给药方案 |
| 2.2.4 细胞培养与药物处理 |
| 2.2.5 血清生化分析 |
| 2.2.6 组织石蜡包埋 |
| 2.2.7 H&E染色 |
| 2.2.8 Masson三色胶原染色 |
| 2.2.9 Sirius Red染色 |
| 2.2.10 免疫荧光染色 |
| 2.2.11 免疫组织化学染色 |
| 2.2.12 TUNEL检测 |
| 2.2.13 蛋白印迹实验 |
| 2.2.14 RT-PCR实验分析 |
| 2.2.15 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 25-OCH_3-PPD改善TAA诱导的肝损伤 |
| 2.3.2 25-OCH_3-PPD减弱与肝星状细胞激活相关的促纤维化细胞因子的转录 |
| 2.3.3 25-OCH_3-PPD可降低肝组织中炎症因子水平 |
| 2.3.4 25-OCH_3-PPD抑制P2X7r调节NLRP3炎症小体 |
| 2.3.5 25-OCH_3-PPD调节PI3K/Akt磷酸化改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.6 25-OCH_3-PPD调节LKB1/AMPK-SIRT1信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.7 25-OCH_3-PPD促进LXRs和FXR活性改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.8 25-OCH_3-PPD阻断TAA诱导的小鼠肝细胞凋亡 |
| 2.3.9 25-OCH_3-PPD通过调节P2X7r-NLRP3抑制肝星状细胞的活化 |
| 2.3.10 25-OCH_3-PPD调节活化的肝星状细胞中LXRs与磷酸化PI3K/Akt的表达 |
| 2.3.11 抑制活化的HSCs中炎症因子表达是25-OCH_3-PPD改善肝纤维的关键 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 20S-原人参三醇通过调FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 动物给药方案 |
| 3.2.4 细胞存活率 |
| 3.2.5 细胞培养与药物处理 |
| 3.2.6 血清生化分析 |
| 3.2.7 组织石蜡包埋 |
| 3.2.8 H&E染色 |
| 3.2.9 免疫荧光染色 |
| 3.2.10 蛋白印迹实验 |
| 3.2.11 RT-PCR实验分析 |
| 3.2.12 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 M4能够抑制肝星状细胞的活性与增殖 |
| 3.3.2 M4调节活化HSC中ECM的平衡 |
| 3.3.3 M4增加活化的HSC中FXR的表达并与P2X7r抑制有关 |
| 3.3.4 M4抑制活化的HSC中促炎细胞因子的表达 |
| 3.3.5 FXR是M4阻断P2X7r进一步改善肝纤维化和炎症的重要靶点 |
| 3.3.6 M4改善TAA诱导小鼠肝损伤 |
| 3.3.7 M4对TAA诱导小鼠肝纤维化的改善作用 |
| 3.3.8 M4通过FXR/P2X7r信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 3.3.9 M4降低TAA诱导的小鼠肝纤维化肝脏中促炎细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 发表论文目录 |
| 致谢 |
（4）滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英对照表 |
| 前言 |
| 实验技术路线 |
| 第一章 不同剂型铁皮石斛对CCl_4诱导肝纤维化大鼠的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药物与试剂 |
| 1.1.3 主要仪器及器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 分组与模型制备 |
| 1.2.2 大鼠死亡率 |
| 1.2.3 标本采集和留取 |
| 1.2.4 指标检测 |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠肝纤维化模型建立的分析 |
| 1.3.2 两种剂型药物干扰后肝脏指数的变化 |
| 1.3.3 肝组织形态学变化 |
| 1.3.4 TGF-β1表达水平 |
| 1.3.5 大鼠肝功能和肝纤维指标的变化 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 CCl_4诱导的肝纤维化模型可成功复制 |
| 1.4.2 铁皮石斛干预SD大鼠肝纤维化的疗效分析 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 铁皮石斛多糖对活化肝星状细胞LX2的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞种类 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 细胞实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DCP溶液制备 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 采用细胞划痕实验检测DCP对HSC-LX2迁移率的影响 |
| 2.2.4 采用MTT法检测DCP对HSC-LX2增殖抑制率的影响 |
| 2.2.5 采用流式细胞术检测DCP对HSC-LX2细胞凋亡率的影响 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HSC-LX-2一般情况 |
| 2.3.2 DCP对细胞迁徙率的影响 |
| 2.3.3 DCP对HSC-LX2增殖的影响 |
| 2.3.4 DCP对HSC-LX2凋亡率的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Hedgehog信号通路与肝纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对肝纤维化的认识与研究 |
| 1.1 现代医学对肝纤维化流行病学的认识 |
| 1.2 现代医学对肝纤维化发病机制的研究 |
| 1.2.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 1.2.2 肝细胞与肝纤维化 |
| 1.2.3 枯否细胞与肝纤维化 |
| 1.3 西医治疗 |
| 1.3.1 药物治疗 |
| 1.3.2 肝脏移植 |
| 2 中医药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.1 中医学对肝纤维化病名的沿革 |
| 2.2 中医学中肝纤维化的病因病机 |
| 2.3 中医学对肝纤维化的辨证论治 |
| 2.4 中药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.4.1 单味中药 |
| 2.4.2 中药复方 |
| 2.4.3 针灸治疗及其他 |
| 第二部分 实验内容 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 1.4.1 药物 |
| 1.4.2 50%的CCl4 溶液配制 |
| 1.4.3 制备秋水仙碱 |
| 1.4.4 制备10%的水合氯醛 |
| 1.4.5 制备4%多聚甲醛固定液 |
| 1.4.6 封闭液 |
| 1.4.7 2XSDS蛋白上样缓冲液 |
| 1.4.8 电泳液 |
| 1.4.9 1X转膜液 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 肝纤维化大鼠模型的制备及给药方法 |
| 2.1.1 分组方法 |
| 2.1.2 造模方法 |
| 2.1.3 给药方法 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.2.1 血清标本的采集 |
| 2.2.2 肝脏病理切片制备 |
| 2.3 HE染色制备 |
| 2.4 Masson染色制备 |
| 2.5 血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量的测定 |
| 2.6 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达 |
| 2.6.1 肝组织样本的采集 |
| 2.6.2 肝组织内总RNA的提取 |
| 2.6.3 RNA浓度的测定 |
| 2.6.4 反转录反应 |
| 2.6.5 Real-time q PCR扩增 |
| 2.7 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、CollagenI、Collagen III蛋白的表达 |
| 2.7.1 组织样本的采集 |
| 2.7.2 肝组织内总蛋白的提取 |
| 2.7.3 总蛋白的保存 |
| 2.7.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.7.5 转膜 |
| 2.7.6 封闭 |
| 2.7.7 孵育抗体 |
| 2.7.8 发光显影 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠肝脏病理学形态的影响 |
| 3.1.1 大鼠一般情况 |
| 3.1.2 肝脏组织肉眼变化 |
| 3.1.3 肝组织病理学观察 |
| 3.2 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的影响 |
| 3.2.1 柔肝化纤颗粒对血清中ROS表达的影响 |
| 3.2.2 柔肝化纤颗粒对血清中MDA含量的影响 |
| 3.2.3 柔肝化纤颗粒对血清中SOD含量的影响 |
| 3.2.4 柔肝化纤颗粒对血清中GSH-Px含量的影响 |
| 3.3 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达的影响 |
| 3.3.1 柔肝化纤颗粒对PKCαmRNA表达的影响 |
| 3.3.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 mRNA表达的影响 |
| 3.3.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA mRNA表达的影响 |
| 3.3.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin mRNA表达的影响 |
| 3.3.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I mRNA表达的影响 |
| 3.3.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III mRNA表达的影响 |
| 3.4 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 柔肝化纤颗粒对PKCα蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA蛋白表达的影响 |
| 3.4.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin蛋白表达的影响 |
| 3.4.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I蛋白表达的影响 |
| 3.4.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的理论基础 |
| 4.1.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的疗效研究 |
| 4.1.2 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的机制研究 |
| 4.2 氧化应激反应与肝纤维化 |
| 4.3 PKCα/Nrf2/ROS信号通路与肝纤维化 |
| 4.4 α-SMA、E-cadherin与肝纤维化 |
| 4.5 Collagen I、Collagen III表达与肝纤维化 |
| 4.6 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激在肝脏疾病中的作用及相关治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及发表论文和参加科研情况说明 |
（6）化肝纤方联合恩替卡韦治疗乙型肝炎相关肝纤维化的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 肝纤维化理论研究 |
| 1 肝纤维化的中医文献研究 |
| 1.1 病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 从“积”与“聚”论治肝纤维化 |
| 1.4 调养之法 |
| 2 肝纤维化现代医学研究进展 |
| 2.1 肝纤维化定义 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 乙型肝炎相关肝纤维化发病机制 |
| 2.4 诊断肝纤维化 |
| 2.5 肝纤维化治疗现状 |
| 2.6 抗肝纤维化治疗前景展望 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 研究资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 剔除与脱落 |
| 2 研究方案 |
| 2.1 分组 |
| 2.2 治疗方案 |
| 2.3 观察及疗效评价指标: |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 基线资料 |
| 3.2 治疗后资料 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 化肝纤方临床疗效分析 |
| 1.1 对肝功能的疗效分析 |
| 1.2 对HBV DNA的疗效分析 |
| 1.3 对肝纤维化指标的疗效分析 |
| 1.4 对血流动力学的疗效分析 |
| 1.5 对中医综合疗效的分析 |
| 2 化肝纤方的运用基础 |
| 2.1 化肝纤方组方理论 |
| 2.2 组方药物分析 |
| 3 从“肝络”、“瘀血”论治肝纤维化 |
| 4 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 综述 中医药治疗乙肝相关肝纤维化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（7）基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药防治肝硬化的研究现状 |
| 1 肝硬化病名渊源 |
| 2 中医对肝硬化病因病机的认识 |
| 3 中医治疗肝硬化思路 |
| 4 导师论治肝硬化的经验 |
| 5 中医药防治肝硬化的机制探讨 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 弹性蛋白及其调控因子在早期肝硬化中的作用 |
| 1 流行病学 |
| 2 肝硬化现代研究进展 |
| 3 弹性蛋白在肝硬化发生中的作用 |
| 4 调控弹性蛋白合成的细胞因子 |
| 5 调控弹性蛋白降解的细胞因子 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 益肝消积方对早期肝硬化的干预作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究二 益肝消积方调控弹性蛋白合成干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究三 益肝消积方调控弹性蛋白降解干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）Fibor-Touch评估减重对青海地区CHB和NAFLD肝纤维化逆转的临床价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号说明 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 研究对象与方法 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究内容与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 纳入及排除标准 |
| 2.2.3 本实验所需仪器设备 |
| 2.2.4 检测方法 |
| 2.2.5 技术路线图 |
| 2.2.6 体质量干预 |
| 2.2.7 评价指标 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 研究对象的一般资料 |
| 3.2 三组病例体质量控制效果的比较 |
| 3.3 三组病例不同体质量控制效果的肝弹指标的变化趋势 |
| 3.4 三组病例不同体质量控制效果的生化指标的变化趋势 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 肝脏瞬时弹性检测的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）益气活血方促进肝再生的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气活血方对大鼠部分肝切除术后肝再生的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 益气活血方促进大鼠部分肝切除术后肝再生的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 JNK信号通路在肝再生中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药对肝硬化及肝再生机制影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）甲基化修饰的miR-455-3p/HDAC2在肝纤维化形成和逆转中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物与细胞 |
| 2.2 实验试剂与药品 |
| 2.3 实验仪器与设备 |
| 2.4 实验用试剂和液体的配法 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 小鼠肝纤维化形成进展期和逆转期模型的建立 |
| 3.2 血清ALT/AST的检测方法 |
| 3.3 小鼠原代肝星状细胞的提取分离 |
| 3.4 小鼠肝脏病理学检测 |
| 3.5 LX-2 细胞的培养,活化及逆转 |
| 3.6 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 3.7 实时荧光定量PCR(RT-q PCR) |
| 3.8 Si RNA转染 |
| 3.9 Mi R-455-3p的 mimics与 inhibitor转染 |
| 3.10 流式检测细胞凋亡 |
| 3.11 MSP(甲基化特异性的PCR) |
| 3.12 Ch IP(染色质免疫共沉淀) |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 小鼠肝纤维化形成和逆转模型的成功建立以及HDAC2 在体内外的表达探究 |
| 4.2 miR-455-3p是 HDAC2 的上游靶标 |
| 4.3 miR-455-3p在活化态和失活态LX-2 细胞中的功能 |
| 4.4 miR-455-3p通过靶向HDAC2 从而调控LX-2 细胞的活化增殖与凋亡 |
| 4.5 LX-2 细胞中,DNMT3b和 DNMT1 参与调控miR-455-3p的表达 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 MicroRNAs在肝纤维化进展中的作用 |
| 参考文献 |
四、肝纤维化逆转的研究进展（论文参考文献）
- [1]芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察及其抗肝纤维化血管新生的机制研究[D]. 张荣. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究[D]. 侯丽爽. 延边大学, 2021(02)
- [3]基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究[D]. 宋健. 延边大学, 2021(02)
- [4]滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用[D]. 于亚男. 大理大学, 2021(09)
- [5]基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用[D]. 吕艳杭. 广西中医药大学, 2021
- [6]化肝纤方联合恩替卡韦治疗乙型肝炎相关肝纤维化的临床研究[D]. 黄家程. 广西中医药大学, 2021(02)
- [7]基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究[D]. 张嘉鑫. 北京中医药大学, 2021(01)
- [8]Fibor-Touch评估减重对青海地区CHB和NAFLD肝纤维化逆转的临床价值[D]. 谢寿珍. 青海大学, 2021(01)
- [9]益气活血方促进肝再生的作用及机制研究[D]. 李文聪. 河北医科大学, 2021(02)
- [10]甲基化修饰的miR-455-3p/HDAC2在肝纤维化形成和逆转中的功能和机制研究[D]. 尤鸿美. 安徽医科大学, 2021(01)
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