一、Amplitude recruitment of cochlear potential（论文文献综述）
明瑞杰,魏嘉辉,宗世民,肖红俊[1]（2021）在《细胞自噬与感音神经性听力损失》文中指出自噬是真核细胞重要的物质降解系统之一,自噬小体将待降解物质包裹于其中并与溶酶体融合,以自噬-溶酶体的方式完成对物质的降解。自噬作为一个动态循环系统参与细胞内物质和能量的代谢并维持细胞稳态。自噬在内耳发育异常、衰老、耳毒性药物、噪声暴露等多种因素引起听力损伤过程中均可能发挥保护作用,有成为感音神经性听力损失治疗靶点的潜力。但也有研究指出耳蜗细胞中的自噬亦是导致细胞死亡的原因之一。我们回顾了自噬与感音神经性听力损失的相关文献,总结自噬在感音神经性听力损失发病机制中的作用,探讨自噬作为干预靶点在感音神经性听力损失防治中的潜在价值。
龙海珊,黄丽辉,王佳伟,李杨,傅新星,文铖[2]（2021）在《线粒体脑肌病在眼耳鼻咽喉科及神经内科临床特征分析》文中研究说明目的:探讨线粒体脑肌病（MEM）的耳鼻咽喉科临床特点,结合眼科及神经内科临床表现,为该病的早期诊治提供依据。方法:2001年9月—2020年1月确诊为MEM的28例患者。采集所有受试者的眼耳鼻咽喉科及神经内科相关的家族史、临床症状。检查:纯音听阈,声导抗,畸变产物耳声发射,听性脑干反应,耳蜗微电位,言语识别率;面肌电图,喉肌电图,四肢肌电图及心电图;颞骨CT,颅脑MRI平扫加增强;肌肉活检;mtDNA基因检测。结果:所有患者经肌肉活检和（或）mtDNA基因检测证实为MEM。半数有母系遗传史。耳鼻咽喉科症状:听力损失15例（53.6%）,耳鸣4例（14.3%）,听觉失认1例（3.6%）,面肌无力4例（14.3%）,吞咽困难3例（10.7%）。眼科及神经内科症状:上睑下垂16例（57.1%）,视神经萎缩15例（53.6%）,运动不耐受16例（57.1%）,肌肉萎缩6例（21.4%）,卒中样发作5例（17.9%）。听力损失为感音神经性,表现为听阈提高15例（53.6%）,声导抗均正常,畸变产物耳声发射未引出18例（64.3%）,听性脑干反应阈值提高18例（64.3%）,耳蜗微电位均未记录到,言语识别率下降6例（21.4%）。面肌电图异常4例（14.3%）,喉肌电图异常3例（10.7%）,四肢肌电图异常6例（21.4%）,心电异常8例（28.6%）。颞骨CT均正常,颅脑MRI显示异常改变19例（67.9%）,包括中枢神经脱髓鞘8例（28.6%）、脑白质发育不良6例（21.4%）、脑萎缩5例（17.9%）、多发腔隙性脑梗死改变4例（14.3%）、基底节钙化1例（3.6%）。结论:MEM常见上睑下垂、视听功能障碍、运动不耐受、肌肉萎缩及卒中样发作等眼耳鼻咽喉科及神经内科的多系统损害。耳鼻咽喉科特点为青少年期起病的感音神经性听力损失,多数为双侧对称性渐进性,少数为突聋、急性耳鸣、听觉失认。临床许多不明原因、伴有多系统损害的听力损失患者应考虑做mtDNA基因检测。中年以后逐渐加重的面肌无力和吞咽困难者应做肌肉活检。耳声发射和听性脑干反应比主观检查更敏感,听力监测有助于评估病程进展。
冯帅[3]（2021）在《长时程低强度环境噪声对年龄相关性耳聋影响的研究》文中研究说明目的:随着城市化建设的飞速发展,城市居民长期暴露在环境噪声污染中。既往有研究表明环境噪声影响听觉皮层重塑而导致行为的异常,但长期暴露于环境噪声对内耳和听力的影响尚待明确,并且环境噪声在听觉老化中的作用仍不清楚。本研究拟通过给予老年性聋模型小鼠长时程低强度的宽频带白噪声,模拟城市环境噪声,来研究噪声与年龄叠加因素对耳聋发生发展的影响,为耳聋的防控工作提供重要依据。研究方法:将8周龄成年C57BL/6J小鼠置于70分贝声压级的连续宽频带白噪声中,每天8小时,连续3个月,来模拟环境噪声对听觉的影响。对照组在相同的时间置于安静的隔声室内。噪声组和对照组分别在实验1个月及3个月时利用听性脑干反应ABR在2-32k Hz的频率范围内评估小鼠的听力程度,以及测量ABR波Ⅰ的波幅评价内毛细胞带状突触的神经传递功能。在上述时间点ABR听功能测试后处死小鼠,分别取各组小鼠的耳蜗,剥离基底膜进行铺片及耳蜗切片。免疫组化染色后经激光共聚焦显微镜观察基底膜形态及测量内毛细胞带状突触的数量,利用耳蜗图观察突触数量损失与听觉功能的对应关系。经HE染色观察螺旋神经元细胞的密度变化。利用扫描电镜观察内、外毛细胞纤毛的形态。体外实验中,取出生3天的C57BL/6J幼鼠的耳蜗,分离基底膜进行体外组织培养,分别加入40 mg/mL的D半乳糖持续48小时模拟老化效应,以及0.5 mM的NMDA和kainate混合液持续12小时模拟谷氨酸兴奋性毒性效应。进行免疫组化染色激光共聚焦显微镜观察内毛细胞带状突触的数量变化和螺旋神经纤维数量变化。之后取各组基底膜组织进行Western blot及ELISA检测进行分子机制的研究。将所得数据使用Graph Pad Prism 5软件进行统计学分析,在满足正态分布和方差齐性检验后,两组比较采用独立样本t检验,多组比较采用方差分析。结果:1.ABR阈值:实验1个月时,噪声组与对照组无显着性差异。至实验3个月时,在16k Hz、24k Hz、32k Hz高频范围,对照3月组的阈值高于对照1月组,差异有统计学意义。与对照3月组相比,噪声3月组在全部频率范围阈值均有不同程度的上升,最集中的范围为8-24 k Hz的中间频段。2.内毛细胞带状突触的数量:对照1月组与噪声1月组无显着性差异。与对照1月组相比,对照3月组自距蜗顶50%位置至末端出现下降,差异有统计学意义。与对照3月组相比,噪声3月组突触的缺失几乎影响了整个耳蜗的全长,其中最严重的是中间部位（自蜗顶30-70%的位置）。突触数量改变与ABR的改变相符合。3.90dB SPL声强下ABR波Ⅰ振幅:实验1个月时,噪声组与对照组无显着性差异。对照3月组和对照1月组相比,波Ⅰ振幅在16k Hz、24k Hz、32k Hz下降,差异有统计学意义。与对照3月组相比,噪声3月组全部频率范围振幅均降低,且8-24k Hz频率差异最为显着。波Ⅰ振幅与ABR阈值的改变相一致。4.基底膜形态:与正常8周龄小鼠相比,噪声1个月和3个月的毛细胞排列、毛细胞纤毛形态和螺旋神经元密度无明显变化。5.体外实验中内毛细胞带状突触和螺旋神经纤维的数量:在给予D半乳糖与谷氨酸受体激动剂联合干预后,内毛细胞带状突触数量明显低于对照组,而两个单独干预组与对照组或联合干预组相比较也有显着差异。各组间带状突触减少情况不同,联合干预组带状突触数量变化最大。同时,螺旋神经纤维数量变化与带状突触呈一致趋势,各组间存在显着差异,联合干预组螺旋神经纤维数量最低。6.NLRP3炎性小体及相关通路细胞因子的表达:各干预组中NLRP3的表达较对照组明显升高,各组间差异具有统计学意义,在D半乳糖与谷氨酸受体激动剂联合干预组表达升高最明显。其他与NLRP3相作用的炎性因子caspase-1、IL-1β、IL-18和TNF-α的表达在联合干预组增加最为显着。结论:随着年龄的增长,听力阈值在较高的频率上增加,相应的内毛细胞带状突触在耳蜗中底部附近也受到了损伤。在长时程低强度的环境噪声干预下导致了以中频段为主的近全频率的听力下降,改变了年龄相关性听力损失的模式,造成了更广泛和严重的损害。而且噪声干预下内毛细胞带状突触的数量和功能损伤也累及近耳蜗全长,在耳蜗中段位置出现显着的减低。同时,内毛细胞带状突触的损失不伴有基底膜其他主要结构的损害,表明带状突触是此种噪声所致的耳蜗早期损伤。由此可见,环境噪声的累积作用在程度和范围上均加重了年龄相关性耳聋的进展。在体外模型中,谷氨酸兴奋性毒性和老化的叠加作用表现为内毛细胞带状突触和螺旋神经纤维数量的减少,炎症反应参与了基底膜的这种损伤。因此,长期暴露在低强度的环境噪声和老化的共同作用下,因内毛细胞带状突触的破坏可导致听力损失。本研究阐述了环境噪声暴露引起内耳损伤的病理机制,为听力损失的防治提供了新的方向。
于玉楼[4]（2021）在《内耳特异性敲除Fgf13在小鼠听觉功能中的作用及其机制的研究》文中研究指明耳聋可在400多种综合征中产生,称为综合征性耳聋（syndromic hearing loss,SHL）,约占遗传性耳聋的30%,但大多数综合征性耳聋的发病机制目前尚不明确。前期研究发现,B（?）rjeson-Forssman-Lehmann综合征（BFLS）、Wildervanck综合征（WS）和先天性多毛症（Congenital Generalized Hirsutism,CGH）患者均有耳聋症状。基因图谱检测结果显示,三类患者均出现Fgf13（Fibroblast growth factor 13）基因的功能丧失性突变。但这三类患者综合征性耳聋的发病机理是否与Fgf13的功能丧失性突变有关及Fgf13在听觉系统中的作用均不明确。我们推测:Fgf13可能在听觉系统中具有重要功能,其表达或功能的异常可能是导致耳聋的新的分子机制。为验证此假设,本研究检测了Fgf13在小鼠耳蜗内的表达及定位,并制备了在内耳特异性敲除Fgf13的转基因小鼠（Fgf13 cKO）。利用此敲除小鼠,本文首先在整体动物水平上研究敲除Fgf13对小鼠听觉功能的影响,继而检测敲除Fgf13对小鼠耳蜗整体结构形态的影响,并进一步探究敲除Fgf13导致小鼠产生耳聋的原因及其可能的作用机制。此研究揭示了Fgf13在听觉系统中的重要功能,并提示该基因可能是导致耳聋的潜在候选基因。此研究将为耳聋的致病机制及治疗靶点提供新的思路,具有重要的研究意义。目的:研究内耳特异性敲除Fgf13在小鼠听觉功能中的作用及其作用机制。方法:（1）利用免疫荧光染色及实时定量PCR（qRT-PCR）技术研究FGF13在小鼠耳蜗内的表达及定位。（2）利用loxP/Cre系统构建内耳特异性敲除Fgf13转基因小鼠,并对其进行敲除效率的验证。（3）采用听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）技术研究敲除Fgf13对小鼠听觉功能的影响。（4）利用免疫组织化学技术检测Fgf13敲除对小鼠耳蜗形态学的影响。（5）利用免疫荧光染色和qRT-PCR等技术进一步探究Fgf13敲除导致小鼠螺旋神经元缺失的作用机制。结果:（1）FGF13主要表达在小鼠耳蜗的柯蒂氏器、螺旋神经元、血管纹和支持细胞内。在细胞水平,FGF13表达在螺旋神经元的细胞膜、胞浆和突起部位,以及毛细胞的细胞膜和胞浆,且以内毛细胞表达为主,外毛细胞有少量表达。FGF13在小鼠耳蜗内的表达水平在P0-P60内无明显改变。（2）利用loxP/Cre技术将Fgf13-loxP小鼠与Atoh1-cre小鼠杂交,构建在内耳特异性敲除Fgf13的转基因小鼠,从而实现该基因在耳蜗毛细胞、螺旋神经元和部分支持细胞内的敲除。qRT-PCR结果显示,FGF13在耳蜗内的表达水平下降～66.2%;免疫染色荧光强度显着降低,提示该敲除小鼠的敲除效果良好。（3）Fgf13纯合敲除(Fgf13-/-和Fgf13-/Y)可导致小鼠听觉阈值显着提高,并伴有听性脑干反应I波幅度显着降低,潜伏期增加,而II-IV峰间潜伏期无明显改变。Fgf13杂合敲除小鼠(Fgf13+/-)听觉功能正常。此外,敲除Fgf13对小鼠畸变产物耳声发射听觉阈值无明显改变,提示其外毛细胞功能正常。（4）敲除Fgf13可导致小鼠耳蜗顶至耳蜗基底部Tuj1标记的Ⅰ型螺旋神经元的细胞密度显着降低,且以耳蜗基底部的细胞密度降低最显着。敲除Fgf13对小鼠耳蜗的整体组织形态,包括柯蒂氏器、血管纹、螺旋韧带和盖膜等均无明显影响,但可导致小鼠耳蜗整体螺旋神经元的细胞密度显着降低。毛细胞铺片染色结果显示,敲除Fgf13对小鼠耳蜗内毛细胞和外毛细胞的形态及数目无明显改变。（5）敲除Fgf13导致小鼠耳蜗顶至耳蜗基底部的TUNEL和cleaved caspase-3阳性螺旋神经元的细胞数量均显着增加,提示caspase依赖性凋亡介导了螺旋神经元的缺失。对凋亡相关因子的表达水平进一步检测发现,敲除Fgf13导致小鼠螺旋神经元内促凋亡因子caspase-9、caspase-3、caspase-12、P53、细胞色素C、和Bak的表达水平显着提高,抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的表达水平显着降低,而caspase-8、AIF、Bim和Bax的表达水平无明显改变。对螺旋神经元内细胞色素C的表达和定位检测结果显示,在WT和Atoh1-cre对照小鼠中,细胞色素C在线粒体内成均匀点状分布。而Fgf13 cKO小鼠螺旋神经元内细胞色素C表达水平显着提高,且在细胞质内聚集成斑块状,提示敲除Fgf13导致了细胞色素C向细胞质的释放及线粒体凋亡通路的激活。结论:FGF13主要表达在小鼠耳蜗的柯蒂氏器,螺旋神经元、血管纹和部分支持细胞内。内耳特异性敲除Fgf13可导致小鼠产生感音神经性耳聋。敲除Fgf13导致小鼠螺旋神经元细胞密度显着降低,且神经元的缺失由线粒体凋亡通路所介导。
覃江圆[5]（2020）在《SGNs兴奋毒性机制研究：DR1通过PKC介导水杨酸钠对GABAAR的转运调节》文中进行了进一步梳理水杨酸钠（sodium salicylate,SS）抑制A型γ-氨基丁酸受体（γ-aminobutyric acid type A receptor,GABAAR）的应答是SS致耳蜗螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）兴奋毒性的途径之一,但SS对GABAAR产生抑制作用的机制尚不完全清楚。已经证实多巴胺受体第一家族（dopamine D1-like receptors,DR1）能与神经元中的GABAAR相互作用,抑制GABAAR功能,促进神经元兴奋毒性。在SGNs上,SS可通过DR1抑制GABAAR的表面表达。然而,DR1通过什么机制或位点介导SS对GABAAR的抑制作用仍有待研究。本研究通过全细胞膜片钳、western blot和qPCR技术在功能、蛋白和m RNA三个层面上得出的结果表明,SS可通过DR1促进SGNs表面的GABAAR内吞,从而减弱GABAAR介导的抑制性应答,这一过程是蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）磷酸化依赖的。PKC作用的位点是GABAARβ3 S408/409和GABAARγ2 S327位点,并且PKC磷酸化对γ2亚基的影响程度比β3亚基大。这些机制在SS诱导耳毒性的机制研究中鲜有报道,可为深入理解耳毒性药物的听力损害机制提供新思路。第一部分 SGNs兴奋毒性机制研究:DR1介导水杨酸钠对GABAAR的转运调节背景:DR1可介导SS对GABAAR表面膜蛋白表达的抑制作用,但尚未确定GABAAR胞膜表达的降低是否与受体转运有关,在此过程中,SS是否引起DR1受体转运也需进一步研究。目的:探讨DR1是否通过影响GABAAR的转运来介导SS对GABAAR的抑制作用。方法:分离培养新生大鼠SGNs。采用免疫荧光技术检测DR1（DRd1）与GABAARβ3（GABRβ3）、GABAARγ2（GABRγ2）在SGNs胞膜上的表达情况。采用WB和qPCR技术检测抑制受体内吞前后,SS和/或DR1活动对体外SGNs上GABAARβ3、γ2亚基及DR1表面膜蛋白、总蛋白及m RNA表达的影响。结果:（1）免疫荧光结果显示SGNs上DR1与GABAARβ3和γ2亚基共同表达。（2）WB结果显示,SS、SKF38393（DR1激活剂）、SS+SKF38393均使GABRβ3、GABRγ2表面膜蛋白表达下降。DR1抑制剂SCH23390可完全阻断SKF38393导致的GABRβ3、GABRγ2表面膜蛋白降低,而SCH23390仅能部分阻断SS、SS+SKF38393导致的GABRβ3、GABRγ2胞膜表达减少,说明SS对GABAAR的抑制作用不仅通过DR1介导,还涉及其他分子机制。加入Dynasore抑制受体内吞后,SS和/或SKF38393不再抑制GABRβ3、GABRγ2的胞膜表达。加入Dynasore前后,所有实验组的GABRβ3、GABRγ2总蛋白表达均无明显变化。提示DR1通过促进GABAAR的内吞介导SS对GABAAR的抑制作用。（3）加入Dynasore前后,所有实验组的DRd1表面膜蛋白、总蛋白表达亦无显着变化,说明DR1的受体转运未受影响。（4）qPCR结果显示,SKF38393、SS、SS+SKF38393使GABRβ3 m RNA表达明显升高,这可能是GABRβ3表面膜蛋白降低后的负反馈升高。SCH23390可完全阻断SKF38393所导致的GABRβ3 m RNA表达升高,只能部分阻断SS、SS+SKF38393导致的GABRβ3 m RNA的上调。加入Dynasore后,SKF38393、SS、SS+SKF38393对GABRβ3 m RNA的上调作用被完全阻断。（5）加入Dynasore前后,所有实验组的GABRγ2 m RNA表达均无显着变化。（6）SKF38393、SS、SS+SKF38393使DRd1 m RNA的表达明显升高,加入SCH23390抑制DR1可完全阻断DRd1 m RNA的上调。加入Dynasore并不影响其他药物原本对DRd1 m RNA表达的影响。结论:（1）SS通过DR1促进GABAAR的内吞。（2）SS通过DR1对β3、γ2亚基的m RNA表达差异调节。（3）SS不影响DR1的受体转运。第二部分 SGNs兴奋毒性机制研究:DR1通过PKC依赖的磷酸化介导水杨酸钠对GABAAR的转运调节背景:GABAAR的内吞与磷酸化水平密切相关,PKC是调节GABAAR磷酸化水平的主要蛋白激酶。目的:探讨SS对GABAAR的抑制过程中,DR1是否通过PKC依赖的磷酸化途径介导GABAAR的转运调节。方法:采用全细胞膜片钳技术检测加入PKC抑制剂（Bisindolylmaleimide I,Bis I）后,SS通过DR1对GABA反应电流的影响。采用WB和qPCR技术检测加入PKC抑制剂（Bis I或Chelerythrine Chloride,CC）前后,SS和/或DR1活动对SGNs上GABRβ3、GABRγ2、DRd1表面膜蛋白、总蛋白及m RNA表达的影响。结果:（1）细胞电生理结果显示,（1）0.5m M SS对GABA反应电流的抑制率为45.36%,20μM SCH23390和100μM SCH23390均使0.5m M SS+500μM GABA引出的GABA反应电流增大,分别使0.5m M SS对GABA反应电流的抑制率减小为32.84%、27.92%,在此基础上分别加入Bis I进一步使0.5m M SS对GABA反应电流的抑制率减小为17.22%、10.85%。（2）应用5m M SS可观察到同样结果,5m M SS对GABA反应电流的抑制率为69.57%,20μM SCH23390和100μM SCH23390分别使5m M SS对GABA反应电流的抑制率分别减小为45.50%、40.44%,在此基础上分别加入Bis I进一步使5m M SS对GABA反应电流的抑制率减小为35.86%、29.30%。加入SCH23390后,0.5m M/5m M SS+500μM GABA引出的GABA反应电流变大,证明DR1促进SS对GABA反应电流的抑制效应,同时加入Bis I和SCH23390引出的GABA反应电流比单独加入SCH23390引出的GABA反应电流更大,表明抑制PKC后,SS通过DR1对SGNs的兴奋毒性的效应减弱,DR1通过细胞内PKC磷酸化途径介导SS对GABA反应电流的抑制效应。另外,抑制PKC不能完全阻断SS对GABA反应电流的抑制,说明除PKC途径外还存在其他途径介导SS的效应。（2）SS浓度不变时（均为0.5m M或5m M）,20μM SCH与100μM SCH引出的GABA反应电流无统计学差异（0.5m M SS,P=0.190>0.05;5 m M SS,P=0.179>0.05）,说明20μΜSCH的作用效应基本达到饱和。（3）（1）SKF38393、SS、SS+SKF38393使GABRβ3、GABRγ2表面膜蛋白降低。SKF38393所诱导的GABRβ3、GABRγ2表面膜蛋白降低可被SCH23390完全阻断,而在PKC抑制剂BisⅠ或CC处理后,仅能部分阻断。SS所导致的GABRβ3、GABRγ2表面膜蛋白降低均被SCH23390或BisⅠ或CC部分阻断。（2）抑制PKC前后,所有分组的GABRβ3、GABRγ2总蛋白之间均无显着差异（GABRβ3,F=0.254,P=0.998>0.05;GABRγ2,F=0.317,P=0.993>0.05）。这些结果说明,DR1通过PKC磷酸化介导SS对GABAARs内吞的促进作用。（4）对于GABRβ3,SCH23390和/或BisⅠ、SCH23390和/或CC均部分阻断SS所导致的GABRβ3表面膜蛋白降低。对于GABRγ2,SS所导致的GABRγ2内吞增加被SCH23390或BisⅠ或CC三者之一部分阻断,不同的是,被SCH23390+BisⅠ、SCH23390+CC的共同作用完全阻断,提示PKC磷酸化对β3亚基和γ2亚基有不同程度的影响,对γ2亚基的影响更大（5）加入Bis I或CC前后,所有实验组的DRd1表面膜蛋白、总蛋白表达亦无显着变化,提示抑制PKC未影响各实验组中DR1的受体转运。（6）qPCR结果显示,（1）SKF38393、SS、SS+SKF38393使GABRβ3m RNA表达明显升高。Bis I或CC均只能部分阻断GABRβ3 m RNA的上调。（2）抑制PKC前后,各实验组的GABRγ2 m RNA表达均无显着变化。（3）SKF38393、SS、SS+SKF38393使DRd1 m RNA表达明显升高。SCH23390可完全阻断DRd1 m RNA的上调,而Bis I或CC仅能部分阻断,这也说明在SS和DR1的下游通路上不只存在PKC途径。结论:（1）DR1通过PKC依赖的磷酸化介导SS对GABAAR的转运调节,在此过程中,PKC负向调控GABAAR功能。（2）PKC对GABAAR的磷酸化是DR1介导SS对GABAAR转运调节过程中的部分磷酸化机制。第三部分 SGNs兴奋毒性机制研究:DR1通过PKC调控的GABAAR磷酸化位点背景:GABAARβ3亚基的S408/409位点和GABAARγ2亚基的S327位点均受PKC磷酸化调节。目的:探讨DR1是否通过改变PKC对β3 S408/409、γ2 S327位点的磷酸化水平来介导SS对GABAAR的抑制作用。方法:采用Western Blot技术检测抑制PKC（Bis I或CC）前后,SS和/或DR1活动对β3 S408/409、γ2 S327位点磷酸化水平的影响,以及对PKC总蛋白的影响。结果:（1）SKF38393、SS、SS+SKF38393使β3 S408/409、γ2 S327位点的磷酸化程度增加。SKF38393导致的β3 S408/409、γ2 S327位点的磷酸化增加被SCH23390完全阻断,而被BisⅠ或CC部分阻断。SCH23390或BisⅠ或CC均部分阻断SS对β3 S408/409、γ2 S327位点磷酸化增强的效应。对于β3 S408/409,抑制DR1和/或抑制PKC均部分阻断其磷酸化;对于γ2 S327,抑制DR1或抑制PKC也部分阻断其磷酸化,但同时抑制DR1和抑制PKC则可完全阻断其磷酸化。SS和/或SKF38393作用后,β3 S408/409和γ2 S327位点的磷酸化水平的变化与β3/γ2-GABAAR的内吞变化具有对应性,表明SS使β3 S408/409和γ2 S327的磷酸化程度增加而促进GABAAR内吞,DR1通过PKC介导了这一过程。（2）加入Bis I或CC前后,所有实验组的PKC总蛋白均无统计学差异,说明在SS和/或SKF38393的作用下,PKC总蛋白量没有发生显着改变,但由于抑制PKC后SS和/或SKF38393导致的GABAAR的内吞明显减少,并且β3 S408/409、γ2 S327位点的磷酸化被抑制,说明DR1确实通过PKC磷酸化介导了SS对GABAAR的抑制作用,提示PKC已活化、其磷酸化底物的功能已增强。结论:（1）SS通过DR1增强PKC对GABAARβ3 S408/409、γ2 S327位点的磷酸化,β3 S408/409、γ2 S327的磷酸化水平与GABAAR功能负相关。（2）SS通过DR1使PKC活化但不影响PKC蛋白表达。
张振[6]（2020）在《二次噪声暴露耳蜗损伤及内耳基因治疗路径优化探究》文中研究表明研究背景及目的:单次中等强度噪音暴露即可导致内毛细胞和I型螺旋神经节细胞间突触发生不同程度永久性损伤,且可不伴永久性阈移。人类现实生活中时常重复暴露于各种噪声,尚不明确二次或多次噪声暴露是否加重耳蜗突触损伤,以及该突触损伤是否导致噪音环境中的听功能缺陷。已知重组腺相关病毒（r AAV）携带神经营养因子-3转染内毛细胞过表达可以部分拮抗噪声性突触损伤,但以往研究中采用的耳蜗开窗术存在破坏成年动物耳蜗结构完整性及造成听力损失风险。近期报道的超声微泡技术预处理圆窗膜实现大分子药物内耳递送的研究为我们开拓了新思路。因此,本项目拟评估二次噪声暴露所致的耳蜗突触损伤,尝试优化r AAV基因治疗内耳递送路径。研究方法:听力正常白化豚鼠予以两次噪声暴露（106 d B SPL 2h,间隔4周）,每次暴露后1天和4周行听觉电生理测试后处死,计数高频区突触密度。利用超声微泡技术处理圆窗膜（USM-RWM）后留置含AAV2/Anc80L65-EGFP的明胶海绵,以鼓阶注射组作为对照组,术后2周处死动物,计数转染的内、外毛细胞。研究结果:两次噪声暴露后1天均存在显着的暂时性突触损失,4周后突触密度显着恢复,但仍存在永久性突触损失。第二次噪声暴露后1天的暂时性突触损失显着小于第一次（18.3%vs 56.7%,p<0.001）;噪声暴露后4周,第二次和首次噪声暴露组的突触密度无明显差异。USM-RWM组r AAV转染术后未见阈移,底回内毛细胞r AAV转染效率达98.47%,与鼓阶注射组差异无显着性意义（p=0.376）,外毛细胞达62.52%,显着低于鼓阶注射组（p<0.001）。研究结论:噪声暴露后残存或恢复的突触具有拮抗二次噪声暴露损伤的特性,二次噪声暴露永久性突触损失并无加重;超声微泡技术处理圆窗膜可安全有效促进r AAV耳蜗细胞尤其是内毛细胞的转染。
方巧军[7]（2020）在《羟丙基-β-环糊精对毛细胞鞘脂代谢的调控及死亡命运的影响》文中研究指明WHO最新报告指出,全球大约有4.66亿人患有听力损失,预计到2050年患病人数将增加到9亿。感音神经性聋作为耳聋中重要的分类,主要是由于耳蜗毛细胞、听神经或者听觉中枢传导障碍引起的。目前研究表明,感音神经性聋主要与噪声、药物毒性等因素有关。随着现代社会的迅猛发展,针对各类疾病的药物开发也在快速的发展,然而随着药品种类的增加和药物在体内的积累所带来的的副作用也逐渐显现出来,其中以耳毒性尤为明显。因此对临床使用药物的耳毒性及其作用机制的研究具有重要的理论和临床实践意义。环糊精（Cyclodextrin,CD）是一种由淀粉中提取出来的一系列环状低聚糖类的总称。其具有疏水性内腔结构和亲水性外表面,因此能有效增加客体分子在水中的溶解度。羟丙基-β-环糊精（Hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HPβCD）作为环糊精醚类衍生物,广泛应用于食品、农业、日用化工及医药等诸多领域。相对于环糊精及其他衍生物,HPβCD具有良好的助溶性和低毒性。Niemann–Pick disease type C（NP-C）是一种由NPC基因突变导致细胞内胆固醇及鞘脂积累的代谢类疾病,HPβCD能有效降低胆固醇和鞘脂的积累,从而维持细胞正常生理活动。目前研究表明HPβCD通过内吞作用进入细胞内,进而导致线粒体功能紊乱和氧化应激水平的升高。有研究表明胆固醇在耳蜗外毛细胞膜上积累与外毛细胞电运动相关,外毛细胞电运动相关蛋白Prestin可能作为损伤靶点介导胆固醇和HPβCD的结合,从而损伤外毛细胞。但目前HPβCD在细胞内的损伤机制及对prestin敲除小鼠听力的保护作用仍不清楚。我们通过建立HPβCD急性和慢性损伤模型进一步研究HPβCD对外毛细胞的损伤作用,并在此基础上深入研究其分子机制。在急性损伤模型中,我们通过对5周的CBA/J小鼠腹腔注射HPβCD进一步研究其对外毛细胞和ribbon突触的损伤作用。结果显示:HPβCD处理组的小鼠耳蜗外毛细胞从底转到顶转的损伤程度具有剂量依赖性,且在注射高浓度HPβCD（6000mg/kg）后,耳蜗沟底回的内毛细胞出现了部分丢失;而较低浓度HPβCD（4000mg/kg）损伤后,部分小鼠的耳蜗毛细胞和听觉功能没有受到损伤;此外,在更低浓度（1000mg/kg）HPβCD损伤后,虽然小鼠听觉功能和毛细胞未受到影响,但中转和底转的耳蜗ribbon突触明显受到损伤,并且ribbon突触的损伤程度也表现出剂量依赖性。同时,我们还发现HPβCD对外毛细胞的损伤十分迅速,在5000mg/kg HPβCD损伤13小时后,外毛细胞明显受到损伤,并且外毛细胞中LC3-II的表达明显升高,暗示细胞自噬水平的升高。由于急性损伤模型造成的毛细胞损伤过于严重,我们又通过建立HPβCD慢性损伤模型用来研究HPβCD具体损伤机制。最后我们利用代谢组学分析HEI-OC1细胞中HPβCD损伤对鞘脂代谢的影响,结果显示:HPβCD处理后,细胞内鞘氨醇含量明显下降,而神经酰胺和鞘磷脂明显升高,暗示HPβCD对鞘脂代谢具有重要的调节作用。本课题为以后进一步研究HPβCD的耳毒性机制提供新思路和研究基础。
杨易[8]（2020）在《Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用》文中指出结核病（Tuberculosis,TB）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染而引起的慢性致死性人畜共患传染病。结核病发病机制研究大多集中在Mtb与肺泡巨噬细胞、树突状细胞之间的相互作用,也有研究表明肺泡上皮细胞（Alveolar Epithelial Cells,AEC）同样是Mtb的靶细胞,在抗结核分枝杆菌感染中起着至关重要的作用,但肺泡上皮细胞与结核分枝杆菌相互作用的分子机理尚未阐明。最新研究发现,肺泡上皮细胞Wnt信号可通过与膜受体蛋白结合发挥免疫调控作用。Wnt5a是分泌型糖蛋白类Wnt家族中的重要成员之一,可激活非经典Wnt信号通路,参与细胞炎性反应的分子调控;而SOX2与包括Wnt信号在内的多种细胞信号都有交互式相互作用,是细胞自噬、炎症、凋亡、发育等过程的重要调节器。为揭示Wnt5a信号在肺泡上皮细胞抗结核菌感染中的免疫调控作用,本研究主要解决的关键科学问题为:1.结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞后是否激活Wnt5a和SOX2信号?2.Wnt5a信号和SOX2信号是否参与调控结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞的凋亡过程及TLR信号介导的炎性反应?二者间相互作用的分子机制是什么?本研究在结核分枝杆菌疫苗株BCG感染肺泡上皮细胞A549基础上,分别采用Wnt5a条件培养基、JNK抑制剂SP600125激活或抑制Wnt5a/JNK信号通路,慢病毒过表达SOX2转染A549细胞方式,结合MTT比色法、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术和酶联免疫吸附测定等技术,检测Wnt5a信号通路相关蛋白、TLR信号通路相关蛋白及炎性细胞因子、细胞凋亡相关蛋白的表达水平,探究Wnt5a、SOX2在Mtb感染肺泡上皮细胞A549中的调控作用及其机制,取得如下研究结果:1.Mtb感染A549细胞后,Wnt5a信号通路的关键分子Wnt5a、Ror2、JNK和CamKⅡ在mRNA水平的表达显着上调;与未感染对照组相比,在Wnt5a或BCG单独刺激下,A549细胞中Wnt5a、PKC、CamKⅡ、Fzd5、Ror2和JNK蛋白表达水平显着上调,且Wnt5a与BCG共处理组中Wnt5a、PKC、Fzd5和JNK的表达显着高于BCG单独处理组（P<0.05）;在抑制剂SP600125处理BCG、Wnt5a单独或共同作用的A549细胞后,与对照组相比,各处理组中Wnt5a、Ror2、JNK、p-JNK和AP-1蛋白表达水平均下调,差异极显着（P<0.01）。结果表明:Wnt5a能有效促进BCG感染A549细胞后Wnt5a信号通路的开启,而阻断Wnt5a/JNK信号通路,对BCG单独或与Wnt5a协同作用激活的Wnt5a信号具有抑制作用。2.分别用Wnt5a、BCG单独作用或共同作用A549细胞后,对TLR信号关键分子及炎性细胞因子进行检测,BCG 组和 Wnt5a+BCG 组中 TLR2、TLR6、MyD88、NF-κB、磷酸化 NF-κBp65和IRF5的表达均显着上调,与未感染对照组相比差异极显着（P<0.01）,且Wnt5a+BCG组的表达水平高于BCG组。采用抑制剂SP600125处理A549细胞后,BCG组、Wnt5a+BCG组分别与未处理对照组相比,TLR2、TLR6、MyD88、NF-κB、磷酸化NF-κBp65和IRF5的表达均显着下调（P<0.05）。与未感染对照组相比,Wnt5a+BCG组、Wnt5a和BCG组炎性因子IL-6和TNF-α表达均显着上升,且Wnt5a+BCG组共同处理组表达最高,差异极显着（P<0.01）。研究结果表明,Wnt5a能有效促进BCG感染A549细胞后TLR信号通路的开启,进而促进BCG感染引起的炎性反应,而阻断Wnt5a/JNK信号通路,对BCG单独或与Wnt5a协同作用激活的TLR信号具有抑制作用。3.分别用Wnt5a、BCG单独作用或共同作用A549细胞后,对SOX2蛋白的表达进行检测,Wnt5a组、BCG组和Wnt5a+BCG组中A549细胞SOX2蛋白表达水平均高于对照组,差异极显着（P<0.01）;采用抑制剂阻断JNK信号后,Wnt5a组、BCG组中的SOX2表达水平显着下调。研究结果表明,BCG和Wnt5a可通过Wnt5a/JNK信号途径激活A549细胞中SOX2的表达。4.Wnt5a与BCG作用于A549细胞后的细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白的表达进行检测,结果表明:A549细胞内凋亡小体的数量、细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表达水平、线粒体膜电位下降幅度,细胞内ROS水平,Caspase-3、活化的Caspase-3（C-caspase3）及Cyto C的表达水平均表现为Wnt5a+BCG共处理组>BCG感染组>对照组,而抑凋亡蛋白Bcl-xl的表达水平与之相反。与未感染对照组相比,BCG、Wnt5a单独处理组及共处理组A549细胞内的ROS释放量大幅升高,且NAC预处理组较未处理对照组ROS水平有所下降。研究结果表明,Wnt5a/JNK信号通过增强A549细胞内ROS产生经线粒体凋亡途径促进BCG诱导的A549细胞凋亡。5.在过表达SOX2的A549细胞中,Wnt5a、JNK、p-JNK、CamKⅡ和NAFT蛋白表达较对照组下调;经BCG感染A549细胞后,Wnt5a、JNK、p-JNK和NAFT蛋白表达上调,而过表达SOX2+BCG感染组较BCG单独感染组Wnt5a关键蛋白的表达水平下降;在过表达SOX2的A549细胞中,TLR2、TLR4、TBK-1、TRAF3、IRF3、AP-1和NF-KB p65蛋白表达较对照组上调,BCG感染A549细胞同样表现为TLRs关键蛋白表达上调,而BCG+过表达SOX2组TLR2、IRF-5、NF-κB p65、AP-1、TRAF3、TBK-1和IRF-3蛋白及炎性细胞因子IL-6、TNF-α的表达水平高于未感染对照组但低于BCG单独感染组;与未感染对照组相比,BCG+过表达SOX2组及BCG感染组A549后Bax/Bcl-2、C-Cas3、C-Cas8、C-Cas9表达均上调,而BCG+过表达SOX2组的表达水平低于BCG单独感染组。结果表明,过表达SOX2负反馈抑制了 BCG感染A549细胞后的凋亡及TLR信号介导的炎性反应。综上研究结果,Wnt5a和SOX2在结核分枝杆菌感染肺泡上皮A549细胞的调控作用机制是:结核分枝杆菌感染肺泡上皮A549细胞后,Wnt5a表达上调,激活了 Wnt5a/JNK非经典信号通路,进而促进了 TLR信号的级联放大,诱导细胞凋亡以清除病原菌的感染;同时,Wnt5a信号通路的激活进一步上调了 SOX2的表达。当SOX2过度表达时,能够负反馈抑制BCG感染的肺泡上皮细胞Wnt5a信号、TLR信号介导的炎性反应及细胞凋亡,从而维持上皮组织细胞的稳态。这些发现将为深入研究结核分枝杆菌与宿主肺泡上皮细胞的相互作用机理,阐明宿主上皮细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫应答调控机制提供新的研究思路。
潘宏[9]（2019）在《CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究》文中研究说明CRISPR系统已经成为生物研究中不可或缺的工具之一。至今为止,CRISPR-Cas9不再仅仅是一种基因编辑工具,它的应用领域范围扩展到基因调控、表观遗传编辑、染色质工程和成像等方面,已远远超过了野生型（WT）Cas9本身的基因编辑功能。CRISPR相关新技术的开发和应用将是未来研究的热点问题。本研究主要是应用CRISPR/Cas9系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人的胚胎中对靶基因进行基因编辑,从而探讨这些新技术是否能安全、有效的应用于遗传疾病治疗。首先,本研究通过在小鼠细胞中比较CasRx系统抑制NHEJ途径重要因子Lig4并结合CRISPR/Cas9系统及Cas9-ORF52蛋白（Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白）共表达这两种策略对同源重组效率的影响,证明这两种方法均能显着的提高同源重组的效率,为在临床疾病治疗中实现需要定向碱基插入或靶向点突变的精确基因组编辑应用提供了新的策略。其次,应用BE3碱基编辑系统,即Crispr-stop新技术对小鼠体内3个基因单独或同时进行敲除,旨在可以在F0代中产生直接用于分析的单个或三个纯合突变小鼠,避免繁琐的小鼠繁殖过程并能使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。最后,将单碱基编辑系统,即BE3、ABE7.10分别与传统CRISPR相关技术进行基因编辑效率的比较,结果显示BE3和ABE7.10系统比传统CRISPR相关技术均更具优势。同时还应用BE3系统在人类胚胎中进行碱基编辑,证实BE3系统可在人类三核（3PN）受精卵中进行有效且精确的碱基编辑。主要研究结果如下:1.检测CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究为了提高HDR（homology-directedrepair,HDR）效率,以便能够插入精确的遗传修饰,本实验在小鼠N2A细胞的荧光报告系统中分析比较了两种策略:使用CasRx系统抑制NHEJ（Non-homologous end joining,NHEJ）途径中的关键分子DNA连接酶IV,以及Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV）ORF52蛋白与Cas9蛋白共表达这两种策略。结果发现CasRx系统对DNA连接酶IV的抑制策略使HDR效率提高了1.4倍。当与Cas9系统共表达时,ORF52将HDR效率提高了2.1倍,因此后者略更具优势。此外,使用Cas9-ORF52共表达的策略在小鼠N2A和E14细胞对ACTB和Tubb3基因进行靶向敲入,HDR效率提高了约24倍。Cas9-ORF52共表达策略能有效增强CRISPR/Cas9介导的HDR效率,这对未来涉及精确基因组编辑的相关研究提供了新的途径。2.应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究利用BE3系统进行基因敲除的方法称为Crispr-stop。以小鼠听觉器官耳蜗为实验对象,本实验完成了三个不同的类型的体内实验。首先,通过破坏Atoh1（一种对听觉毛细胞生成至关重要的基因）进行了原理验证测试。其次,单独敲除了三个听觉所必需且在人类耳聋患者中具有频繁的突变率的基因:vGlut3,Otoferlin和Prestin,在F0代直接获得单基因敲除的具有听觉障碍的小鼠模型。最后,成功地同时敲除了vGlut3,Otoferlin和Prestin,F0代直接获得多基因同时敲除的小鼠。研究数据表明Crispr-stop可以在F0产生可直接用于分析单个或三个纯合突变小鼠,缩短了基因敲除的世代间隔及繁琐的小鼠繁殖过程,同时使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。证明体内Crispr-stop是一种非常有效的适用于研究小鼠发育过程中的功能基因的方法。3.单碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率比较及BE3系统对人类胚胎碱基编辑效率的研究本实验中使用的单碱基编辑系统包括BE3及ABE7.10。首先,使用ABE7.10（TadA-TadA*7.10-nCas9）诱导Tyr基因的点突变产生突变小鼠,以期证明ABE7.10在小鼠胚胎中碱基编辑的潜力。在Tyr基因上设计了三个突变位点。通过微注射ABE7.10 mRNA和sgRNA在小鼠受精卵中进行碱基编辑。三个位点突变效率分别为75%、87.5%和75%,碱基编辑率较高。将ABE7.10系统与传统的CRISPR辅助ssODN介导的同源定向修复相比较,ABE7.10系统展示了高碱基编辑效率和低Indels（插入或缺失）率,因此ABE7.10系统在靶向点突变方面更具优势。同时,针对小鼠Tyr基因设计四个基因敲除靶位点,在小鼠胚胎中将BE3系统与CRISPR-Cas9系统进行比较。实验结果表明,当使用单个sgRNA靶向敲除小鼠Tyr基因时,两种方法均会产生一定比率的嵌合小鼠出现。而当使用多个sgRNA时,嵌合率降低或为零。虽然BE3系统与CRISPR-cas9系统对基因敲除都具有很高的效率,但BE3系统产生基因敲除小鼠的嵌合率更低,纯合率更高。综上所述,单碱基突变系统在靶向点突变方面及基因敲除方面比传统CRISPR-cas9技术更具优势。使用BE3和SaKKH-BE3在人类三核（3PN）受精卵中进行基因编辑研究,结果表明BE3和SaKKH-BE3B在HBB,FANCF和DNMT3B三个基因中均具有较高的碱基编辑效率,并且在基因编辑的人胚胎中没有观察到明显的脱靶效应,证明了应用碱基编辑系统纠正未来人类胚胎中的遗传缺陷是可行的。综上所述,通过应用CRISPR系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人类胚胎中去探讨基因编辑的效率、安全性及可行性,为这些技术在未来用于进行构建动物疾病模型及人类疾病治疗的研究中提供了一定的科学依据。
郭荣荣[10]（2019）在《基于人工耳蜗的声电刺激体系对神经干细胞行为的调控规律及作用机制》文中研究说明人工耳蜗是现代医学最成功的人造功能器官之一,它通过将声电转化后的信号直接作用于内耳螺旋神经元从而使患者恢复或获得听力感知。目前,人工耳蜗植入是临床上治疗患有重度、极重度、甚至全聋感音神经性聋的成人以及儿童最有效的治疗措施。但是螺旋神经元在损伤或退化后不能自发再生,因此功能性螺旋神经元的数量不足是影响人工耳蜗植入术后聆听效果的重大医学难题。近年来,干细胞移植已经成为治疗神经退行性疾病最有前景的治疗手段,包括感音神经性聋。因此建立人工耳蜗植入和干细胞移植新综合技术体系有望扩展人工耳蜗植入的适应症,为更多螺旋神经元退化或损伤严重的患者带来福音。大量的基础研究已经表明干细胞移植到内耳后可以再生出神经元,能够用于再生螺旋神经元的干细胞有内耳干细胞,诱导多能干细胞,胚胎干细胞,间充质干细胞以及神经干细胞（NSCs）。然而,干细胞移植在治疗感音神经性聋的过程中仍存在很多有待解决的问题,例如干细胞植入后的存活率过低,移植的干细胞很难迁移至螺旋神经节,移植干细胞的不可控分化以及再生的神经元缺乏功能等。因此如何有效控制干细胞的行为成为关键科学问题之一。组织工程材料的发展为干细胞行为调控提供了新的有效途径,组织工程材料通过模拟细胞微环境（niche）,为移植的干细胞提供必要的物理支撑、三维空间及可控的物化因子等。同时由于神经元的电活动特性,所以,导电组织工程材料作为种子细胞的运输载体和调控手段,有望为人工耳蜗植入和干细胞移植新综合技术体系的临床转化提供新的思路。本研究分别以成熟导电组织工程材料石墨烯和新型潜在导电生物材料碳化钛（Ti3C2Tx）做为神经界面,建立基于人工耳蜗的声电刺激体系,在体外研究人工耳蜗-导电材料声电刺激体系对于NSCs行为的调控,为导电组织工程材料应用于人工耳蜗植入和干细胞移植新综合技术体系提供理论依据,更快的实现人工耳蜗植入适应症的扩展。在本研究中,我们首先通过免疫荧光,蛋白印迹,电生理,钙成像等手段探索了导电衬底石墨烯和碳化钛对NSCs行为的调控规律及作用机制。其次,以此为研究基础,我们首次在体外建立了具有良好生物相容性的人工耳蜗-导电衬底声电刺激体系。最后,我们通过多种细胞生物学和分子生物学研究手段系统的揭示了人工耳蜗-石墨烯声电刺激体系对于NSCs行为的调控规律。在第一部分,我们首先通过真空抽滤将预先制备的Ti3C2Tx溶液均匀的铺在传统细胞衬底TCPS表面,用原子力显微镜、X射线光电子能谱仪、傅里叶红外转换光谱仪等多种设备对Ti3C2Tx衬底进行表征,结果表明Ti3C2Tx衬底具有优良的导电性且含有多种含氧官能团,衬底表面具有无规则的拓扑结构。和TCPS衬底相比,Ti3C2Tx衬底同样具有良好的生物相容性,不会对NSCs产生细胞毒性,最重要的是,Ti3C2Tx衬底同样可以维持NSCs的干性和增殖潜能。然而通过钙成像实验我们发现增殖条件下,Ti3C2Tx可以显着提高NSCs钙瞬变的频率以及同步性。为了进一步解释该现象,我们分析了Ti3C2Tx对NSCs分化能力以及新生神经元的影响,结果显示Ti3C2Tx可以显着提高NSCs分化为神经元的比例,且新生神经元的复杂度更高,但是不会影响新生神经元突触的发育。以上结果说明Ti3C2Tx衬底可以作为一种卓越的神经界面材料,维持NSCs的干性和增殖潜能,促进其分化为神经元。为了研究导电衬底调控NSCs行为的机制,我们通过化学气相沉淀法制备了结构简单、元素组成单一的石墨烯衬底。由于生物材料对细胞最直接和最明显的影响可能是在细胞膜上,而膜上的离子通道和离子泵在调控细胞功能上发挥着重要作用。因此,我们聚焦NSCs的被动和主动电生理特性,同时通过探索石墨烯对NSCs行为的调控阐明NSCs细胞膜生物电特性的发育和NSCs行为改变的关系。在对NSCs细胞膜被动电生理特性的研究中,我们发现无论在增殖还是分化条件下,石墨烯都不会影响NSCs及其子代细胞的电容和输入电阻,但是会促使静息膜电位变得更负,这可能是由于石墨烯促进了细胞膜上机械敏感性门控钾离子通道TREK-1的表达。在对NSCs细胞膜主动电生理特性的研究中,我们通过探究石墨烯对NSCs及其子代细胞动作电位的影响,发现石墨烯可以加速不同发育阶段NSCs细胞膜主动生物电特性的成熟,但是不会影响成熟神经元的离子通道。为了进一步确认生物电特性对新生神经元发育以及成熟的影响,我们通过对分化21天的神经元的树突棘形态、突触蛋白的表达、突触后电流的记录发现石墨烯可以促进新生神经元形态和突触功能成熟。最后,为了解释导电材料对NSCs的调控机制,我们基于以上实验以及COMSOL multiphysics建模提出了一个新的假说:导电的石墨烯能够促使NSCs及其子代细胞本身所产生的微电场强度增加、分布变广,从而促进NSCs细胞膜生物电功能的成熟,进而调控NSCs及子代细胞的结构与功能。该假说也提示着外加电场同样可以调控NSCs的行为发生。在第二部分,我们以石墨烯为神界界面及参考电极,首次在体外建立了基于人工耳蜗的声电刺激体系,该体系可以同时用于多个实验,极大的降低实验成本和时间成本。接着,我们从南京鼓楼医院选取了50例4-5岁语前聋小孩最后一次进行开机调试的数据,初步确定了声电刺激的脉宽、强度、频率。随后,我们以人工耳蜗的直接作用靶点螺旋神经元为研究对象,优化该体系使其具有良好的细胞相容性,可用于研究声电刺激对于螺旋神经元和干细胞的调控规律和作用机制。同时我们还发现长时间刺激螺旋神经元可以促进神经突的生长,这种促进作用可能和生长锥的发育有关。值得注意的是,该体系也可用于包括Ti3C2Tx在内的所有导电组织工程材料。在第三部分,我们归纳了人工耳蜗-石墨烯声电刺激对NSCs的调控规律。复合频率的高幅度声电刺激不仅具有明显的神经毒性,而且还能降低NSCs的增殖潜能。在探究为什么人工耳蜗-石墨烯声电刺激系体会产生神经毒性的过程中,我们发现这种毒性作用是刺激时间和刺激幅度依赖的,降低刺激幅度后神经毒性明显减弱,NSCs的增殖能力也得到了部分恢复。进一步的深入探究,我们发现人工耳蜗-石墨烯声电刺激系体的神经毒性来源于高频声电刺激,单纯的低频刺激不仅不会产生神经毒性,而且还会促进NSCs的增殖。这种促进作用在以Ti3C2Tx为衬底的声电刺激体系中也得到了验证。同时,在人工耳蜗-石墨烯声电刺激对NSCs分化行为的研究中,我们同样发现复合频率高幅度声电刺激会抑制干细胞分化为神经元的能力,但是单纯的低频刺激不仅可以显着提高神经元的分化效率,而且还能促进新生神经元突触的发育。因此我们可以通过对基于人工耳蜗的声电刺激体系中频率、幅度、刺激时间单参数或多参数的综合调节调控NSCs的存活、增殖、分化潜能,为在体控制移植后干细胞、新生神经元的数量和质量提供了可能。
二、Amplitude recruitment of cochlear potential（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Amplitude recruitment of cochlear potential（论文提纲范文）
（2）线粒体脑肌病在眼耳鼻咽喉科及神经内科临床特征分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 检查方法 |
| 1.2.1 听力学 |
| 1.2.2 肌电图 |
| 1.2.3 影像学 |
| 1.2.4 肌肉活检和mtDNA基因检查 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般特征 |
| 2.1.1 性别及发病年龄 |
| 2.1.2 家族史 |
| 2.2 MEM临床表现 |
| 2.3 体征 |
| 2.4 听力学 |
| 2.5 肌电图 |
| 2.6 影像学 |
| 2.7 肌肉活检和基因学 |
| 2.8 诊断 |
| 3 讨论 |
| 3.1 发病年龄和常见症状 |
| 3.2 听力学特点 |
| 3.3 面肌无力和吞咽困难的特点 |
（3）长时程低强度环境噪声对年龄相关性耳聋影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 长时程低强度噪声对年龄相关性耳聋听损模式和基底膜结构的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验相关溶液的配置 |
| 2.2.1 0.01M磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)配制 |
| 2.2.2 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)溶液配置 |
| 2.2.3 10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic Acid, EDTA)溶液配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物与噪声暴露 |
| 2.3.2 听觉评估 |
| 2.3.3 组织学制备 |
| 2.3.4 免疫组织化学染色 |
| 2.3.5 耳蜗频率映射 |
| 2.3.6 共聚焦显微镜成像 |
| 2.3.7 电子显微镜成像 |
| 2.3.8 石蜡切片及苏木精和伊红染色 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 长期暴露在环境噪声中因带状突触的破坏导致听力损失 |
| 3.2 长期暴露于环境噪声改变年龄相关性耳聋的听损模式 |
| 3.3 长期暴露于环境噪声所致听力损失可不损伤基底膜其他主要结构 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 谷氨酸兴奋性毒性和老化效应对内毛细胞带状突触和螺旋神经的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验相关溶液的配置 |
| 2.2.1 0.01M PBS配制 |
| 2.2.2 4% PFA溶液的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 耳蜗基底膜体外培养 |
| 2.3.2 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 共聚焦显微镜成像 |
| 2.3.4 蛋白质免疫印迹试验 |
| 2.3.5 酶联免疫吸附试验 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 体外模型中耳蜗兴奋性毒性和衰老的综合效应 |
| 3.2 炎症反应参与兴奋性毒性和老化对基底膜的损伤 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 钙粘蛋白23与耳聋相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）内耳特异性敲除Fgf13在小鼠听觉功能中的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 内耳特异性敲除Fgf13对小鼠听觉功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 内耳特异性敲除Fgf13对小鼠耳蜗形态学的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Fgf13敲除导致小鼠螺旋神经元细胞缺失的作用机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 凋亡在感音神经性耳聋中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）SGNs兴奋毒性机制研究：DR1通过PKC介导水杨酸钠对GABAAR的转运调节（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 SGNs兴奋毒性机制研究:DR1介导水杨酸钠对GABA_AR的转运调节 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SGNs的形态学观察 |
| 2.2 细胞免疫荧光检测DRd1(DR1基因名称)、GABRβ3、GABRγ2的表达 |
| 2.3 抑制受体内吞前后,SS和/或DR1活动对GABRβ3、GABRγ2、DRd1表面膜蛋白及总蛋白表达的影响 |
| 2.4 抑制受体内吞前后,SS和/或DR1活动对GABRβ3、GABRγ2、DRd1 mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 SGNs兴奋毒性机制研究:DR1通过PKC依赖的磷酸化介导水杨酸钠对GABA_AR的转运调节 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 急性分离的SGNs及膜片钳中SGNs的鉴定 |
| 2.2 抑制PKC后 SS通过DR1对GABA反应电流的影响 |
| 2.3 抑制PKC前后,SS和/或DR1活动对GABRβ3、GABRγ2、DRd1表面膜蛋白及总蛋白表达的影响 |
| 2.4 抑制PKC前后,SS和/或DR1活动对GABRβ3、GABRγ2、DRd1 mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 SGNs兴奋毒性机制研究：DR1通过PKC调控的GABA_AR磷酸化位点 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 抑制PKC前后,SS和/或DR1活动对β3 S408/409、γ2 S327位点磷酸化水平的影响 |
| 2.2 SS和/或DR1活动对PKC总蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 多巴胺及其受体与耳鸣机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）二次噪声暴露耳蜗损伤及内耳基因治疗路径优化探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语对照表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 二次噪声暴露致耳蜗突触损伤评估 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 超声微泡技术预处理圆窗膜促r AAV耳蜗基因转染 |
| 2.1 前沿 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（7）羟丙基-β-环糊精对毛细胞鞘脂代谢的调控及死亡命运的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 内耳结构和听觉传导 |
| 1.1.1 听觉传导 |
| 1.1.2 内耳结构 |
| 1.1.3 带状体突触结构 |
| 第二节 听力测量 |
| 1.2.1 听性脑干反应 |
| 1.2.2 畸变产物耳声发射 |
| 第三节 细胞死亡信号通路 |
| 1.3.1 细胞凋亡概论 |
| 1.3.2 细胞自噬概论 |
| 1.3.3 细胞坏死概论 |
| 第四节 鞘脂代谢概论 |
| 1.4.1 神经酰胺代谢与细胞命运决定 |
| 1.4.2 鞘磷脂代谢与细胞命运决定 |
| 1.4.3 鞘氨醇代谢与细胞命运决定 |
| 1.4.4 鞘脂代谢关键酶与细胞命运决定 |
| 1.4.5 代谢组学概论 |
| 第五节 HPβCD概论 |
| 1.5.1 环糊精的发现与发展 |
| 1.5.2 HPβCD的应用 |
| 1.5.3 HPβCD研究进展 |
| 1.5.4 HPβCD的耳毒性研究现状 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 实验小鼠和细胞的准备 |
| 2.2.2 ABR |
| 2.2.3 畸变产物耳声发射 |
| 2.2.4 小鼠耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.2.5 突触免疫荧光染色 |
| 2.2.6 新生鼠基底膜培养 |
| 2.2.7 HEI-OC1 细胞培养 |
| 2.2.8 流式细胞分析技术 |
| 2.2.9 鞘脂代谢分析 |
| 2.2.10 成年鼠基底膜DAB染色 |
| 2.2.11 毛细胞和突触计数的方法 |
| 2.2.12 统计学分析方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一节 HPβCD对耳蜗毛细胞损伤情况的研究 |
| 第二节 HPβCD对小鼠听觉功能的影响 |
| 第三节 HPβCD对小鼠内毛细胞ribbon突触的影响 |
| 第四节 HPβCD对外毛细胞自噬的影响 |
| 第五节 HPβCD急性损伤模型的建立 |
| 第六节 Z-VAD-FMK在 HPβCD急性损伤模型中的作用 |
| 第七节 HPβCD慢性损伤模型的建立 |
| 第八节 HPβCD离体损伤模型的建立 |
| 3.8.1 HPβCD耳蜗损伤培养模型的建立 |
| 3.8.2 HPβCD细胞损伤模型的建立 |
| 第九节 HPβCD对 OC1 细胞鞘脂代谢的影响 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 第一节 鞘脂代谢对细胞命运决定的影响 |
| 第二节 HPβCD的应用与耳毒性 |
| 第三节 小结与展望 |
| 4.3.1 小结 |
| 4.3.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述及目的意义 |
| 1.1 结核病与结核分枝杆菌 |
| 1.1.1 结核病的流行病学 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌 |
| 1.1.3 肺泡上皮细胞(AECS)与结核分枝杆菌相互作用的研究进展 |
| 1.2 Wnt5a信号通路 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 Wnt5a信号在炎症性疾病的作用研究 |
| 1.2.3 Wnt5a信号对细胞凋亡的调节作用 |
| 1.3 SOX2信号通路 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 SOX2信号对炎症反应的调节作用 |
| 1.3.3 SOX2信号对细胞凋亡的调节作用 |
| 1.4 Wnt信号与SOX2的相互作用研究进展 |
| 1.5 科学问题和研究目的意义 |
| 第二章 Wnt5a对BCG感染肺泡上皮细胞TLR信号介导的炎性反应调控作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞系与菌株 |
| 2.2.2 试剂及常用耗材 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 PCR引物 |
| 2.2.5 抗体 |
| 2.2.6 常用溶液的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验技术路线 |
| 2.3.2 A549细胞培养 |
| 2.3.3 结核分枝杆菌培养 |
| 2.3.4 Wnt5a条件培养基制备 |
| 2.3.5 结核分枝杆菌感染A549细胞模型的建立 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR |
| 2.3.7 Western blotting分析 |
| 2.3.8 ELISA法检测Wnt5a蛋白浓度 |
| 2.3.9 MTT噻唑蓝比色法检测A549细胞存活率 |
| 2.3.10 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 结核分枝杆菌感染对A549细胞Wnt5a信号通路的影响 |
| 2.4.2 外源Wnt5a促进BCG感染的A549细胞TLR信号相关蛋白的表达 |
| 2.4.3 外源Wnt5a促进BCG感染的A549细胞SOX2表达 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Wnt5a信号调控BCG感染肺泡上皮A549细胞凋亡的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株与细胞系 |
| 3.2.2 主要试剂、实验耗材及试剂配制 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验设计及技术路线 |
| 3.3.2 细胞复苏、传代、冻存和计数 |
| 3.3.3 BCG菌株培养 |
| 3.3.4 Wnt5a条件培养基制备 |
| 3.3.5 Wnt5a和BCG作用A549细胞后凋亡小体的检测 |
| 3.3.6 Wnt5a和BCG作用A549细胞后凋亡率的检测 |
| 3.3.7 Wnt5a和BCG作用A549细胞后总活性氧水平的检测 |
| 3.3.8 Wnt5a和BCG作用A549细胞后线粒体膜电位的检测 |
| 3.3.9 Wnt5a和BCG作用A549细胞后凋亡相关蛋白表达的检测 |
| 3.3.10 数据统计分析、软件作图 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Wnt5a促进BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 3.4.2 Wnt5a增加ROS产生进而促进BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 3.4.3 Wnt5a/JNK信号介导的内源性凋亡途径促进BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 SOX2调控BCG感染肺脏上皮A549细胞炎性反应及细胞凋亡的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞系、菌株与慢病毒载体 |
| 4.2.2 主要试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验设计及技术路线 |
| 4.3.2 细胞系的培养 |
| 4.3.3 BCG菌株培养 |
| 4.3.4 SOX2过表达A549稳定转染细胞株的建立与鉴定 |
| 4.3.5 BCG感染A549细胞Wnt5a信号、TLR信号和细胞凋亡相关分子检测 |
| 4.3.6 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 稳定转染过表达SOX2细胞株的建立与鉴定 |
| 4.4.2 过表达SOX2抑制BCG感染A549细胞Wnt5a/JNK信号转导 |
| 4.4.3 过表达SOX2抑制BCG感染A549细胞TLR信号介导的炎性反应 |
| 4.4.4 过表达SOX2抑制BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 基因组编辑技术的发展 |
| 1.2 基因组编辑相关的靶向核酸酶的发展 |
| 1.3 CRISPR作为基因组编辑技术的兴起 |
| 1.4 不同的CRISPR系统及其在基因组编辑中的应用 |
| 1.5 CRISPR-Cas9 系统应用的再开发 |
| 1.6 CRISPR-Cas9 系统功能的开发应用 |
| 1.6.1 第二代CRISPR基因编辑工具的发展 |
| 1.6.2 CRISPR介导的基因表达调控 |
| 1.6.3 CRISPR介导的表观基因组编辑的发展与应用 |
| 1.6.4 CRISPR介导的活细胞染色质成像技术的发展 |
| 1.6.5 大规模遗传和表观遗传学的CRISPR筛选技术发展 |
| 1.7 CRISPR新技术未来发展方向 |
| 1.8 本课题的目的、研究意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 利用CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52 蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.2 主要实验材料、器材及仪器 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.1.1 细胞实验 |
| 2.2.1.2 分子克隆 |
| 2.2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 相关载体的构建 |
| 2.3.2 相关g RNA靶序列的设计和载体的构建 |
| 2.3.3 构建小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系 |
| 2.3.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光 |
| 2.3.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因 |
| 2.3.6 应用CasRX系统抑制小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率 |
| 2.3.7 通过共转ORF52 蛋白提高同源重组效率 |
| 2.3.8 通过共转ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 载体的构建 |
| 2.4.2 gRNA靶序列的设计和载体的构建 |
| 2.4.3 小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系产生及鉴定 |
| 2.4.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光 |
| 2.4.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因 |
| 2.4.6 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率 |
| 2.4.7 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高同源重组效率 |
| 2.4.8 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第二章 应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.2.1 胚胎培养实验 |
| 3.1.2.2 分子克隆试剂 |
| 3.1.2.3 主要仪器设备 |
| 3.1.2.4 主要使用抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 single-guide RNAs(sgRNAs)的设计 |
| 3.2.2 体外转录PCR模板准备 |
| 3.2.3 sgRNA体外转录与纯化 |
| 3.2.4 BE3 的体外转录与纯化 |
| 3.2.5 sgRNA优化,小鼠内耳/尾基因分型,靶向深度测序和TA克隆测序 |
| 3.2.6 样品处理,组织学和免疫荧光 |
| 3.2.7 全基因组测序和脱靶分析 |
| 3.2.8 听觉脑干诱发电位(ABR)测量 |
| 3.2.9 制备外毛细胞膜片钳的方法 |
| 3.2.10 内毛细胞膜片钳和电容测量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 使用CRISPR-stop对小鼠中的Tyr基因进行碱基编辑 |
| 3.3.2 小鼠耳蜗中CRISPR-STOP的原理验证测试 |
| 3.3.3 CRISPR-STOP可有效产生不同程度耳聋的小鼠模型 |
| 3.3.4 Prestin和 otoferlin基因敲除小鼠也具有听力缺陷的电生理学特性 |
| 3.3.5 CRISPR-STOP技术可同时敲除多基因 |
| 3.3.6 在v Glut3,otoferlin和 prestin三敲小鼠中未观察到脱靶效应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第三章 碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率的比较及BE3系统对人类3PN胚胎的碱基编辑效率的研究 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.2.1 胚胎培养实验 |
| 4.1.2.2 分子克隆试剂 |
| 4.1.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 single-guide RNAs(sgRNAs)的设计 |
| 4.2.2 体外转录PCR模板准备 |
| 4.2.3 sgRNA体外转录与纯化 |
| 4.2.4 Cas9、ABE7.10和BE3 or SaKKH-Be3 的体外转录与纯化 |
| 4.2.5 人类胚胎的收集 |
| 4.2.6 胚胎注射 |
| 4.2.7 胚胎鉴定与靶位点深度测序 |
| 4.2.8 单个卵裂球测序分析 |
| 4.2.9 全基因组测序和脱靶分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 与CRISPR-Cas9 系统相比,使用ABE在小鼠胚胎中的Tyr基因中进行更有效的碱基编辑 |
| 4.3.2 在小鼠胚胎中BE3 系统比CRISPR-Cas9 系统进行更有效的基因敲除 |
| 4.3.3 人类3PN受精卵中的高效碱基编辑 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）基于人工耳蜗的声电刺激体系对神经干细胞行为的调控规律及作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 神经干细胞移植治疗感音神经性聋 |
| 1.1 感音神经性聋 |
| 1.2 人工耳蜗植入治疗感音神经性聋 |
| 1.3 干细胞移植治疗感音神经性聋 |
| 第二节 神经干细胞的行为调控 |
| 2.1 细胞行为的调控方式 |
| 2.2 干细胞行为的物化调控方式 |
| 2.3 导电材料及电刺激对神经干细胞行为的调控 |
| 第三节 石墨烯和碳化钛 |
| 3.1 石墨烯在组织工程及再生医学领域的应用 |
| 3.2 碳化钛在生物医药领域的应用 |
| 第二章 解决的关键科学问题和实验设计 |
| 第一节 解决的关键科学问题 |
| 第二节 实验设计 |
| 第三章 实验材料和方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 1.1 大型设备 |
| 1.2 小型仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验耗材 |
| 1.5 试剂配制 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.1 实验小鼠的准备 |
| 2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.3 细胞爬片的处理 |
| 2.4 石墨烯和碳化钛Ti_3C_2T_x的制备 |
| 2.5 NSCs的提取和培养 |
| 2.6 NSCs的传代 |
| 2.7 NSCs的冻存和复苏 |
| 2.8 SNGs的提取和培养 |
| 2.9 EdU标记和免疫荧光染色 |
| 2.10 扫描电子显微镜细胞样品处理 |
| 2.11 RT-qPCR |
| 2.12 流式测细胞周期 |
| 2.13 钙成像记录和分析 |
| 2.14 数据处理及统计 |
| 第四章 实验结果和讨论 |
| 第一节 导电衬底MXene对神经干细胞行为调控的研究 |
| 1.1 MXene(Ti_3C_2T_x)的表征 |
| 1.2 MXene(Ti_3C_2T_x)对神经干细胞增殖行为的调控 |
| 1.3 MXene(Ti_3C_2T_x)对神经干细胞分化行为的调控 |
| 1.4 Ti_3C_2T_x对神经干细胞钙震荡的影响 |
| 第二节 导电衬底石墨烯对神经干细胞行为调控的机制研究 |
| 2.1 石墨烯的表征 |
| 2.2 石墨烯对NSCs细胞膜被动生物电特性的影响 |
| 2.3 石墨烯对机械敏感性门控钾离子通道TREK-1的影响 |
| 2.4 石墨烯对NSCs细胞膜主动生物电特性的影响 |
| 2.5 石墨烯对新生神经元发育以及功能成熟的影响 |
| 2.6 石墨烯对NSCs所处微电场的影响 |
| 第三节 人工耳蜗声电刺激体系的建立和表征 |
| 3.1 人工耳蜗-石墨烯声电刺激体系的建立 |
| 3.2 人工耳蜗-石墨烯声电刺激体系的参数设定及表征 |
| 3.3 人工耳蜗-石墨烯声电刺激体系的生物相容性评估 |
| 第四节 人工耳蜗-石墨烯声电刺激对神经干细胞的行为调控 |
| 4.1 基于人工耳蜗-石墨烯体系的全频声电刺激对NSCs增殖潜能的影响 |
| 4.2 基于人工耳蜗-石墨烯体系的声电刺激对NSCs增殖潜能的调控 |
| 4.3 基于人工耳蜗-MXene(Ti_3C_2T_x)体系的声电刺激对NSCs增殖潜能的调控 |
| 4.4 基于人工耳蜗-石墨烯体系的声电刺激对于NSCs分化行为的调控 |
| 第五章 尚待解决的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、Amplitude recruitment of cochlear potential（论文参考文献）
- [1]细胞自噬与感音神经性听力损失[J]. 明瑞杰,魏嘉辉,宗世民,肖红俊. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2021(07)
- [2]线粒体脑肌病在眼耳鼻咽喉科及神经内科临床特征分析[J]. 龙海珊,黄丽辉,王佳伟,李杨,傅新星,文铖. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2021(06)
- [3]长时程低强度环境噪声对年龄相关性耳聋影响的研究[D]. 冯帅. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]内耳特异性敲除Fgf13在小鼠听觉功能中的作用及其机制的研究[D]. 于玉楼. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]SGNs兴奋毒性机制研究：DR1通过PKC介导水杨酸钠对GABAAR的转运调节[D]. 覃江圆. 广西医科大学, 2020
- [6]二次噪声暴露耳蜗损伤及内耳基因治疗路径优化探究[D]. 张振. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]羟丙基-β-环糊精对毛细胞鞘脂代谢的调控及死亡命运的影响[D]. 方巧军. 东南大学, 2020(01)
- [8]Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用[D]. 杨易. 宁夏大学, 2020
- [9]CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究[D]. 潘宏. 广西大学, 2019(06)
- [10]基于人工耳蜗的声电刺激体系对神经干细胞行为的调控规律及作用机制[D]. 郭荣荣. 东南大学, 2019(01)