一、中华眼镜蛇神经毒素cDNA的克隆及表达(英文)（论文文献综述）
王璠[1]（2019）在《中华眼镜蛇咬伤中毒兔模型建立及其抗蛇毒血清作用时效性的研究》文中认为背景:毒蛇咬伤中毒是一种全球性的常见公共卫生问题,与许多人的生命健康与人身安全息息相关。在中国,公认的具有剧毒的毒蛇有十种,俗称“中国十大毒蛇”,其中分布最广的毒蛇是中华眼镜蛇。中华眼镜咬伤中毒主要的临床表现为皮肤软组织局部肿胀、坏死,严重者导致截肢,甚至死亡。使用抗眼镜蛇毒血清是治疗其咬伤中毒的首要选择,蛇咬伤中毒后及时有效地应用抗眼镜蛇毒血清能获得更好的临床疗效和预后。目前尚缺少符合中华眼镜蛇咬伤中毒临床特点的动物模型。因此,通过改进建模技术和方法,建立新的中华眼镜蛇咬伤中毒动物模型,并应用该模型研究抗眼镜蛇毒血清作用的时效性,对探索中华眼镜蛇咬伤中毒新的、更有效的临床治疗方案,解决我国毒蛇咬伤中毒的现状有着积极的意义。目的:本研究旨在建立符合中华眼镜蛇咬伤中毒临床特点的兔模型以及应用该模型研究抗眼镜蛇毒血清作用的时效性。方法:使用不同剂量的中华眼镜蛇蛇毒溶液肌肉注射入新西兰大白兔右下肢,比较临床表现以及生存情况,筛选出建立模型的目标蛇毒注射量,再检测其实验室检查指标及病理检查结果,验证其与中华眼镜蛇咬伤中毒临床特点和表现相对一致的兔模型,确定标准化的建模方法。并在此模型的基础上,在注毒后的0分钟、3分钟、5分钟、10分钟;15分钟、30分钟、60分钟、90分钟及2小时、6小时、12小时、24小时分别对新西兰大白兔静脉注射抗眼镜蛇毒血清,比较临床表现、生存情况以及相关实验室检查指标的变化,探究抗眼镜蛇毒血清作用的时效性。结果:1.原液的1/8倍（0.466 mg/kg）含量组的兔死亡率低于10%,且其坏死面积与1/7倍（0.533mg/kg）含量组差异无统计学意义,最终确定中华眼镜蛇咬伤中毒兔模型的目标剂量为以0.466 mg/kg的中华眼镜蛇蛇毒干粉和8.0 ul/kg H2O混合溶液。其血常规检查中,注毒后2小时出现明显的白细胞计数、红细胞比容、血小板比容、中性粒细胞百分比升高。其血生化检查中,注毒后2小时,出现明显的注毒天门冬氨酸氨基转移酶升高;注毒后24小时,出现明显的肌酸激酶同工酶MB、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶升高。局部部位病理组织学检查结果符合细胞坏死表现。2.中华眼镜蛇咬伤中毒后进行抗眼镜蛇毒血清静脉注射并不能改善实验动物的坏死情况。中华眼镜蛇咬伤中毒后2小时进行抗眼镜蛇毒血清注射,可出现天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、肌酐降低;中华眼镜蛇咬伤中毒后30分钟进行抗眼镜蛇毒血清注射,可出现明显的肌酸激酶同工酶MB、间接胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、肌酐浓度降低;中华眼镜蛇咬伤中毒后15分钟内进行抗眼镜蛇毒血清注射,可出现明显的肌酸激酶同工酶MB、总胆红素、间接胆红素、天门冬氨酸氨基转移酶、肌酐、尿素浓度降低;结论:1.以0.466 mg/kg的中华眼镜蛇蛇毒干粉和8.0 ul/kg H20混合溶液可成功构建符合中华眼镜蛇咬伤中毒临床特点的兔模型。2.中华眼镜蛇咬伤中毒后静脉注射抗眼镜蛇毒血清对局部坏死面积的改善不明显。3.中华眼镜蛇咬伤中毒后30分钟内进行抗眼镜蛇毒血清静脉注射有助于心肌、肝脏以及肾脏功能的改善。
胡玲玲[2]（2017）在《银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定》文中提出以蛇入药治疗多种疾病在我国已有相当悠久的历史。银环蛇（Bungarus multicinctus）俗称金钱白花蛇,隶属于脊索动物门、爬行纲、有鳞目、眼镜蛇科、环蛇属。中医学认为金钱白花蛇味甘、咸,性温、有毒,具有祛风、通络、定惊、止痒、止痉的功能。蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液,作为一类天然的动物毒素蛋白,其含有多种酶类蛋白、非酶蛋白和其他小分子物质,并具有广泛的生物学活性和药理作用,最明显的特征就是具有极强的毒性。银环蛇蛇毒含有多种活性成分,是复杂的混合物,主要以神经毒素为主。中医历来有“以毒攻毒”的治疗法则,研究表明蛇毒中含有纤溶、促凝、镇痛、抗癌等方面的药理功能成分,具有降压、镇痛、消炎和抗肿瘤作用。目前为止,蛇毒液中的某些活性成分经过修饰和改造已被制成成品药,用于临床上疾病的治疗。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展以及日益成熟,越来越多的科研人员将研究重点转移到动物药中多肽物质的研究与开发上来,动物药成为寻找与开发天然活性药物的源泉。因此,探究银环蛇蛇毒的成分以及其发挥药理作用的活性物质具有极其重要的理论和现实意义。本研究利用Illumia HiseqTM2500技术构建且分析银环蛇的转录组文库。使用Trinity拼接软件对所得到的序列进行De novo拼接,最终共获得63,947条高质量的 Unigene（>200bp）,总长度为 64,485,567 bp,其中最长 Unigene 为 23,902 bp,最短为200 bp,平均长度为1008 bp,N50为1806 bp。通过Blastx搜索五大数据库进行基因功能注释,共有21,900条（34.25%）Unigene在NR数据库中存在着相似序列。在NR库注释中筛选出与毒素有关的Unigene,显示银环蛇蛇毒富含神经毒素。同时,分别有17,987条（28.13%）、13,963条（21.84%）、6981条（10.92%）、15,964 条（24.96%）Unigene 在 SWISSPROT、KOG、KEGG和GO数据库中注释成功。结果表明,构建的银环蛇转录组文库质量较高,筛选获得的毒素相关Unigene为银环蛇功能基因的分子克隆、蛇的药用价值研究奠定了基础。采用三步层析纯化法,即凝胶过滤层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析,从银环蛇粗毒中分离纯化得到一种新的L-氨基酸氧化酶,并命名为Bm-LAAO,每500 mg银环蛇蛇毒中纯化得到4.40 mg的LAAO,约占蛇毒总蛋白质含量的0.88%。纯化得到的Bm-LAAO的总活力为297.81 U,酶的比活力为67.70 U/mg,通过RP-HPLC技术和SDS-PAGE均证实其为均一蛋白。通过肽质量指纹图谱分析发现,本研究分离得到的银环蛇LAAO的蛋白序列与NCBI数据库中银环蛇LAAO的cDNA序列高度相符合。Bm-LAAO是一种糖基化的黄素蛋白酶,在还原条件下,其表观分子质量约为62.5 KDa。大部分的蛇毒LAAO在37℃左右活性最高,然而,Bm-LAAO的反应最适温度为45℃,最适pH分别为8.4。酶动力学研究表明,此酶对疏水性L-氨基酸具有较高的催化活性,且不能催化D-氨基酸的氧化脱氨反应,最好的底物基质是L-Met、L-Leu、L-Phe。研究发现去糖基化的Bm-LAAO的酶活力下降了 54.3%,说明糖基化对银环蛇的酶活性有较大的影响。储存温度同样对Bm-LAAO也很重要,相对而言,-80℃是最佳的储存温度。利用PCR技术,本研究从提取的银环蛇毒腺总RNA中克隆出了Bm-LAAO的cDNA序列,该序列编码一条由496个氨基酸残基组成的成熟肽。并采用蛋白质的同源建模技术,以哈里氏蝮蛇毒LAAO的晶体结构作为模板,预测Bm-LAAO的三维结构。本研究利用抑制肿瘤细胞增殖作用的体外实验对Bm-LAAO的抗肿瘤活性进行测定,采用MTT法测定其对肿瘤细胞和人正常细胞增殖能力的影响,采用显微镜及流式细胞仪观察和检测Bm-LAAO对肿瘤细胞的细胞凋亡作用的影响。在所检测的11种肿瘤细胞株中,Bm-LAAO对人胃癌细胞MGC-803具有最强的增殖抑制活性,其IC50为314 ng/ml;对三种人乳腺癌细胞BT474、MDA-MB-231、MCF-7的IC50分别为378、1213、1480 ng/ml,而对正常人乳腺细胞MCF-10A的IC50为13,556 ng/ml,分别是上述三种人乳腺癌细胞的35.86倍、11.18倍和9.16倍。研究表明,相对于正常细胞,Bm-LAAO对肿瘤细胞具有较强的选择性和细胞毒性。当过氧化氢酶及Bm-LAAO共同作用肿瘤细胞时,细胞活性恢复了 75%,表明在很大程度上,Bm-LAAO对细胞的增殖抑制活性可能是LAAO催化过程中产生的H2O2所致。流式细胞仪分析结果显示Bm-LAAO可以诱导MGC-803和MCF-7细胞凋亡,且呈现剂量依赖性的方式,而过氧化氢酶Catalase可以很大程度上减弱Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用,提示Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用也可能与H2O2的产生有关。综上所述,本研究构建并分析了银环蛇的转录组文库,且克隆得到了Bm-LAAO的基因序列;从银环蛇粗毒中分离纯化得到了 LAAO,并对其体外抗肿瘤作用和诱导细胞凋亡作用的机制进行了初步的研究,这为进一步深入地探讨其作用机制和可能的实际应用奠定了基础。
鄢航[3]（2013）在《广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测》文中进行了进一步梳理眼镜蛇神经毒素（Neurotoxin, NT）是一种潜在的麻醉剂和解毒药物,在医用研究领域发挥巨大的作用。但由于蛇毒的产量小且分离难度大,限制了蛇毒在医用上的应用范围。因此,本研究旨在利用昆虫杆状病毒表达系统在体外获得具有镇痛活性的广西眼镜蛇蛇毒蛋白（Cobortoxin, CT）和凝脂酶A2（Phospholipase A2, PLA2）。分别利用分段克隆和反转录PCR的方法克隆了广西眼镜蛇CT和PLA2基因的编码序列。然后将携带和不携带His标签的CT和PLA2插入杆状病毒穿梭载体pFastBacTM Dual启动子PH和p10的下游,获得不携带His标签的重组质粒：pD-CT、pD-PLA2、pD-CT-PLA2和携带His标签的重组质粒：pD-H-CT、pD-H-PLA2、pD-HCT-HPLA2。将6种穿梭载体转入DH10Bac中,用抗生素（庆大霉素、卡那霉素和四环素）和蓝白斑筛选、PCR和测序鉴定,得到携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体：BM-CT、BM-PLA2、BM-CT-PLA2、BM-HCT, BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。利用转染试剂CellfectinⅡ将携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体和空载体转入Sf9昆虫细胞,经PCR鉴定,成功获得了7种病毒颗粒。用病毒颗粒感染细胞,经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达,结果显示,在细胞裂解上清中检测到特异目的条带,提示目的蛋白是可溶的。分别利用电洗脱和Ni柱亲和纯化的方法成功从细胞裂解上清中纯化出不携带His标签的目的蛋白CT和PLA2和携带His标签的目的蛋白HCT和HPLA2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性,结果显示：CT镇痛效果极显着（P<0.05）,并且Ni柱纯化的效果显着好于电洗脱（P<0.05）。HPLA2的镇痛效果不很明显（P>0.05）。
鄢航,杨秀荣,邓继贤,郭亚芬,兰干球,蒋钦杨,蒋和生[4]（2012）在《广西眼镜蛇神经毒素的原核表达》文中认为引言眼镜蛇神经毒素（Neurotoxin）是眼镜蛇中表达丰度较高的一类毒素,是眼镜蛇毒中的主要致死成分。是一种潜在的麻醉剂和解毒药物。由于眼镜蛇毒神经毒素止痛具有无成瘾性和无耐药性,因此在吸毒者戒毒方面也是前景广阔。目前,大部分的神经毒素分离自眼镜蛇分泌的毒素。由于眼镜蛇的数量和分泌量有限,而且分离过程需要比较昂贵的设备和复杂的工艺流程,并且得到的医用的神经毒素量很少,因此其价格都比较昂贵。广西的气候条件为动
鄢航,杨秀荣,邓继贤,郭亚芬,兰干球,蒋钦杨,蒋和生[5]（2012）在《广西眼镜蛇神经毒素的原核表达》文中进行了进一步梳理利用拼接PCR法从广西眼镜蛇基因组DNA中获得CT成熟肽序列,序列分析显示,广西眼镜蛇与其他地区眼镜蛇的CT基因成熟肽序列具有较高的同源性,同时成功构建了pET30 a（+）-CT原核表达载体;研究结果表明,利用拼接PCR的方法能有效拼接两个外显子序列,广西眼镜蛇CT基因具有较高的保守性,CT基因可在大肠杆菌中表达。
陈瑜,许云禄[6]（2009）在《蛇毒蛋白基因克隆与高效表达的研究进展》文中研究指明蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的毒液,属于生物毒素,其化学成分很复杂,是一类有酶活性和其他生物活性的蛋白质和多肽的混合物,具有广泛的生物学活性,可作为天然的药用资源。目前通过捕蛇或养蛇提取蛇毒存在局限性,所以采用基因工程生产高纯度的蛇毒蛋白成为当前及今后的研究方向。本文就蛇毒蛋白基因克隆与高效表达的研究进展作一综述。
林起庆[7]（2009）在《眼镜王蛇咬伤的临床特点及抗蛇毒血清治疗效果分析》文中进行了进一步梳理目的总结眼镜王蛇咬伤中毒的临床特点,探讨使用2种抗蛇毒血清治疗在不同的给药方法情况下对机械通气时间的影响作用。方法收集2004年4月至2009年5月间我院以及我们到其他医院会诊抢救共22例眼镜王蛇咬伤致严重中毒需要行机械通气患者的临床资料进行总结分析。根据抗蛇毒血清不同的给药方法把患者分成2组;A组:抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清序贯使用;B组:抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清混合后使用。使用统计学方法,比较两组的机械通气时间。结果（1）临床特点:22例均出现呼吸肌麻痹,平均伤后至呼吸停止时间为（128.18±27.83）min,最小呼吸停止时间为30min,最大呼吸停止时间为270min。22例均出现全身炎症反应综合症（SIRS）。（2）治疗效果:22例患者均被治愈;全部患者均需要予机械通气,A组平均机械通气时间:（58.58±11.43）h,最小通气时间36h,最大通气时间89h;B组平均机械通气时间（24.10±3.50）h,最小通气时间17h,最大通气时间34h。B组呼吸支持时间明显短于A组（P＜0.01）。结论眼镜王蛇咬伤患者出现呼吸麻痹时间早,严重者可出现呼吸衰竭甚至呼吸停止。部分患者出现心、肝、肾等脏器功能损害。在本组资料中,所有患者均需要予机械通气。给予抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍治疗效果显着,其中混合使用抗蛇毒血清与序贯使用抗蛇毒血清这两种方法比较,混合使用抗蛇毒血清组能明显缩短机械通气时间。
陈瑜[8]（2009）在《舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆、表达及免疫学活性鉴定》文中指出目的蛇毒是一种成分复杂的天然生物毒素,含有多种酶类和药理活性多肽,就眼镜蛇（Naja naja atra）蛇毒而言,含有细胞毒素（cytotoxin,CTX）、神经毒素（neurotoxin,NT）和多种酶类等,其中CTX在体外对多种瘤细胞具有直接溶解作用。从蛇毒中分离细胞毒素资源有限,成本高,技术难,质量标准难统一。本文拟应用基因克隆的方法,构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（+）- CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。旨在为开发眼镜蛇毒细胞毒素作为抗肿瘤药物提供药学和药理学资料;也为深入研究细胞毒素结构与功能关系创造条件。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端及C-末端的氨基酸序列并据此设计引物,含KpnⅠ酶切位点、SacⅠ酶切位点。P1:5’-GGGGTACCAAAACTCTGCTGCTGACCTTG-3’, P2:5’-CGAGCTCTCAGTTGCATCTGTCTGTATTG-3’,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,RT-PCR方法合成扩增其中的细胞毒素基因序列（CTX cDNA）。将CTX cDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（+）中,获得重组DNA（pET42α（+）- CTX）,经KpnⅠ/ SacⅠ酶切鉴定后,热激转化至大肠杆菌DH5α。获得单克隆（CTX-pET42α（+）-DH5α）增殖后,抽提质粒,并用KpnⅠand SacⅠ双酶切图谱分析、T7引物PCR和DNA序列测定,鉴定阳性转化子DNA序列,该序列与文献报导的蛇毒CTX基因序列一致;将鉴定确认的阳性转化子重组质粒（pET42α（+）-CTX）,应用CaCl2法转化至大肠杆菌表达菌E.coli BL21（DE3）中,测序鉴定。IPTG诱导CTX融合蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物;GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX,Western-blotting方法鉴定表达产物的抗原性。结果1. RT-PCR扩增得到的CTX cDNA243bp左右,与预期的CTX基因大小基本一致。2.构建原核表达质粒pET42α（+）- CTX,经双酶切、T7引物PCR和DNA序列测定,证实CTX基因已正确插入质粒载体的多克隆位点。得知CTX的cDNA大小约为243bp。3.在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中成功表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶电泳显示CTX以可溶性蛋白及包涵体形式存在,融合蛋白分子量为:37.9kD。4.纯化得到融合CTX,具有眼镜蛇毒细胞毒素的抗原性。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得CTX融合蛋白具有眼镜蛇毒细胞毒素的抗原性。
宋慧[9]（2007）在《广西眼镜蛇毒中NGF和Natrin的分子生物学及性质研究》文中进行了进一步梳理目的:对来源于广西眼镜蛇毒的神经生长因子（NGF）蛋白的基因进行体外扩增、克隆及序列分析,并表达。研究广西眼镜蛇毒神经生长因子诱导人类小涎腺腺样囊性癌细胞（NACC）凋亡的影响。方法:采用Trizol法从广西眼镜蛇毒腺中提取总RNA,经RT-PCR扩增出广西眼镜蛇毒中的NGF的cDNA,测序后与其它来源的NGF比较同源性;将来源于广西眼镜蛇毒的NGF蛋白的基因克隆至融合表达载体pET-40b（+）中,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达出NGF。利用蛋白印迹分析其是否有NGF抗原活性及用PC12细胞进行生物活力测定并通过细胞计数法与天然蛇毒NGF的活性比较。应用HE染色观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。结果:广西眼镜蛇毒中的NGF可在大肠杆菌中克隆和表达。DNA软件分析其有110 Amino Acids,Molecular Weight为12346.93 Daltons,等电点为7.643。经蛋白印迹分析可知其具有NGF抗原活性,PC12细胞生物活力测定结果显示经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,为进一步研究NGF的结构和功能关系提供更多的信息。形态学观察到用药后的NACC细胞质空泡、核固缩、核染色质聚集等形态学变化现象。流式细胞仪检测到试验组细胞凋亡率高于对照组,说明广西眼镜蛇毒神经生长因子能诱导NACC细朐凋亡。目的:从广西眼镜蛇毒中分离纯化出Natrin,测定其生物化学性质;对来源于广西眼镜蛇毒中的Natrin蛋白基因进行体外扩增、克隆及序列分析,并表达;探讨蛇毒蛋白Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用（LPO）的影响,广西眼镜蛇毒Natrin是否对胃癌MGC-803细胞有诱导凋亡的作用。方法:广西眼镜蛇毒经过CM-SepharoseCL-6B柱、Sephadex G-50柱及FPLCmono S柱层析,分离纯化出Natrin;从广西眼镜蛇毒腺中抽提总RNA,经过RT-PCR得到cDNA作模板,根据广西眼镜蛇毒液中分离纯化的Natrin的N-端及C-端部分氨基酸序列的测定结果设计了兼并引物,利用PCR的方法扩增和克隆了Natrin。将来源于广西眼镜蛇毒Natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体PMAL-c2x中,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃经0.3mMIPTG诱导表达4小时。超声破菌后,将上清液经Amylose树脂柱上纯化后,经蛋白印迹分析其是否有Natrin抗原活性。采用肝细胞匀浆硫代巴比妥酸比色法（体外法）,加入一系列浓度样品,然后测定大鼠肝脏线粒体脂质过氧化作用产物丙二醛（MDA）含量。采用MTT法测定眼镜蛇毒Natrin对胃癌MGC-803细胞生长活力的影响;用AO/EB双染色法、双免疫荧光染色（Annexin V/PI）和流式细胞仪技术检测广西眼镜蛇毒Natrin对胃癌MGC-803细胞的凋亡作用。结果:成功地从广西眼镜蛇毒中分离纯化出Natrin,经SDS-PAGE测定分子量为25KD,质谱测定分子量为24937Da,等电聚焦电泳pI约为8.3,测得N端的序列为NVDFNSESTRRKKKQKEIVD;广西眼镜蛇毒的Natrin可在大肠杆菌中克隆和表达。经蛋白印迹分析可知其具有Natrin抗原活性,说明Natrin在大肠杆菌中成功地表达了,为进一步研究Natrin的结构和功能关系提供更多的信息。在探讨蛇毒蛋白Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用（LPO）的影响中随着Natrin的浓度增高,其对大鼠肝脏具有一定的抑制作用。广西眼镜蛇毒Natrin对胃癌MGC-803细胞有诱导凋亡作用。
李晶[10]（2006）在《眼镜王蛇三指毒素新基因的克隆、表达及重组长链神经毒素的功能研究》文中研究表明三指毒素是一类由有着极其相似三级结构的低分子量（＜10kDa）毒素组成的家族。本文根据NCBI的检索结果，依据眼镜王蛇神经毒素高度保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR，得到了眼镜王蛇神经毒素的部分基因序列，进而采用3’RACE法首次得到了眼镜王蛇6种三指毒素共19条新基因的全长cDNA序列。这6种三指毒素分别是长链神经毒素、短链神经毒素、弱神经毒素、心脏毒素、毒蕈碱毒素以及含有一个游离巯基的长链神经毒素。通过对cDNA编码区与非编码区同义及非同义突变频率的分析，论述了王蛇中三指毒素基因的进化方式为压力下的达尔文正选择。根据所构建的进化树在一种毒蛇内对五种三指毒素的进化关系进行了分析，并提出了眼镜王蛇的长链神经毒素与海蛇科的短链神经毒素有更近的进化关系。 通过序列分析，我们选取了眼镜王蛇三指毒素19种cDNA中的14种，利用pGEX-4T-1质粒在E.coli中对其进行了表达初筛，结果表明所有的重组毒素均能够大量表达，除心脏毒素外大多数毒素有部分可溶性表达。我们选取了两个最具代表性的长链毒素（rLNTX1与rLNTX3）进行更深入的研究，摸索表达与酶切条件，建立了使用GST柱-苯甲脒柱串连纯化酶切液中重组神经毒素的纯化工艺。经过Tris／tricine SDS-PAGE、体积排阻HPLC和RP-HPLC测定重组毒素的纯度以及飞行时间质谱测定分子量、N端氨基酸测序、圆二色散光谱等鉴定步骤，对其进一步定量定性，为下一步的功能研究打下了良好的基础。 通过急性毒性实验，我们测定了rLNTX1与rLNTX3的半数致死量，进而利用全细胞膜片钳技术对其抑制烟碱诱发电流的能力进行了检测，两个重组毒素均显示明显的突触后神经毒活性。但是，在LD50测定中观察到小鼠呈现的一些异常表现结合克隆表达阶段中的现象，我们又通过MTT法对这两个毒素可能的细胞毒活性进行了检测，它们展示出与心脏毒素相似的细胞毒活性。我们从一级序列结构以及疏水性角度出发，对这两个重组毒素在神经毒与细胞毒活性上的差异进行了合理的解释。
二、中华眼镜蛇神经毒素cDNA的克隆及表达(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中华眼镜蛇神经毒素cDNA的克隆及表达(英文)（论文提纲范文）
（1）中华眼镜蛇咬伤中毒兔模型建立及其抗蛇毒血清作用时效性的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 中华眼镜蛇咬伤中毒兔模型的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 观察指标 |
| 1.3 观察终点 |
| 1.4 造模成功标准 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.7 小结 |
| 第二部分 抗眼镜蛇毒血清作用的时效性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 观察指标 |
| 2.3 观察终点 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.6 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 中华眼镜蛇咬伤中毒治疗的研究概况 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 中药动物药之蛇类入药 |
| 第二章 蛇类毒素的研究概况 |
| 2.1 蛇类毒素的转录组研究 |
| 2.2 蛇类毒素的蛋白组研究 |
| 第三章 蛇毒L-氨基酸氧化酶的研究进展 |
| 3.1 蛇毒L-氨基酸氧化酶的组成和结构功能 |
| 3.2 蛇毒L-氨基酸氧化酶的药理学活性与应用价值 |
| 3.2.1 细胞毒性作用 |
| 3.2.2 诱导细胞凋亡作用 |
| 3.2.3 对血小板聚集功能的影响 |
| 3.2.4 抑菌作用 |
| 3.2.5 抗肿瘤作用 |
| 3.2.6 其他作用 |
| 3.3 蛇毒L-氨基酸氧化酶分离、纯化与异源表达 |
| 3.3.1 粗毒中LAAO的分离、纯化 |
| 3.3.2 异源重组表达 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 银环蛇毒腺高通量测序转录组文库的构建及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 毒蛇 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转录组文库构建及测序流程 |
| 4.2.2 毒腺的分离 |
| 4.2.3 总RNA的提取 |
| 4.2.4 总RNA的纯化 |
| 4.2.5 mRNA碎片化 |
| 4.2.6 转录组文库的构建与库检 |
| 4.2.7 上机测序 |
| 4.2.8 测序数据预处理 |
| 4.2.9 De novo拼接 |
| 4.2.10 生物信息学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 总RNA的制备与分析 |
| 4.3.2 测序数据过滤处理 |
| 4.3.3 拼接转录本分析 |
| 4.3.4 基因功能注释 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第五章 银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与结构鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 蛇毒、菌种 |
| 5.1.2 层析柱和主要试剂 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Sephadex G-75分离柱的安装 |
| 5.2.2 银环蛇粗毒的分离 |
| 5.2.3 Bm-LAAO的分离纯化及鉴定 |
| 5.2.4 Bm-LAAO的理化性质 |
| 5.2.5 酶学性质 |
| 5.2.6 酶促动力学 |
| 5.2.7 去糖基化 |
| 5.2.8 储存温度 |
| 5.2.9 Bm-LAAO的基因克隆 |
| 5.2.10 基因序列分析 |
| 5.2.11 三维空间结构建模 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 银环蛇粗毒分离 |
| 5.3.2 Bm-LAAO的分离纯化及肽质量指纹图谱分析 |
| 5.3.3 Bm-LAAO的理化性质分析 |
| 5.3.4 Bm-LAAO的纯化效率 |
| 5.3.5 酶学性质鉴定 |
| 5.3.6 酶促动力学分析 |
| 5.3.7 糖基化及储存温度对Bm-LAAO活性的影响 |
| 5.3.8 Bm-LAAO基因及蛋白序列分析 |
| 5.3.9 Bm-LAAO的三维结构 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 银环蛇粗毒的分离 |
| 5.4.2 Bm-LAAO的分离纯化 |
| 5.4.3 Bm-LAAO的理化性质 |
| 5.4.4 Bm-LAAO的酶学性质 |
| 5.4.5 Bm-LAAO的序列及结构分析 |
| 5.4.6 Bm-LAAO的原核表达 |
| 第六章 银环蛇L-氨基酸氧化酶的抗肿瘤活性分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 细胞株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 银环蛇组分的细胞增殖抑制率检测 |
| 6.2.2 Bm-LAAO对细胞生长的半抑制浓度(IC50)测定 |
| 6.2.3 Bm-LAAO对细胞凋亡作用的检测 |
| 6.2.4 H_20_2对细胞的增殖和凋亡作用的检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 银环蛇组分的细胞活力检测 |
| 6.3.2 Bm-LAAO抑制细胞的增殖 |
| 6.3.3 Bm-LAAO诱导细胞的形态学发生改变 |
| 6.3.4 Bm-LAAO可能通过产生H_20_2影响细胞的增殖和凋亡 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.4.1 LAAO对多种肿瘤细胞具有杀伤作用 |
| 6.4.2 LAAO对细胞凋亡的诱导作用 |
| 6.4.3 Bm-LAAO诱导肿瘤细胞凋亡的机理分析 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（3）广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 眼镜蛇神经毒素 |
| 1.1 眼镜蛇神经毒素的种类 |
| 1.2 眼镜蛇神经毒素的结构 |
| 1.3 眼镜蛇神经毒素的作用 |
| 1.4 眼镜蛇神经毒素分离纯化概述 |
| 2 眼镜蛇蛇毒蛋白 |
| 2.1 眼镜蛇毒蛋白的发现 |
| 2.2 眼镜蛇毒蛋白的结构 |
| 2.3 眼镜蛇毒蛋白的功能 |
| 3 凝脂酶A_2 |
| 3.1 蛇毒凝脂酶A_2的作用原理和结构 |
| 3.2 蛇毒凝脂酶A_2的作用 |
| 4 广西眼镜蛇概述 |
| 5 昆虫杆状病毒表达载体研究进展 |
| 5.1 昆虫杆状病毒转移载体和原理 |
| 5.2 昆虫杆状病毒表达系统的优越性 |
| 6 研究目的和意义 |
| 第二章 广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的克隆和序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广西眼镜蛇血液的DNA提取 |
| 2.2 广西眼镜蛇毒腺RNA提取 |
| 2.3 广西眼镜蛇毒腺cDNA的内参基因(GAPDH)PCR检测 |
| 2.4 CT目的基因成熟肽序列的获得 |
| 2.5 PLA_2目的基因成熟肽序列的获得 |
| 2.6 两种基因四种pMD质粒的鉴定 |
| 2.7 测序结果 |
| 2.8 同源性分析 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 神经毒素基因来源的选择 |
| 3.2 成熟肽序列克隆方法的比较 |
| 3.3 神经毒素的保守性 |
| 3.5 小结 |
| 第三章 CT和PLA_2昆虫表达载体的构建和体外表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单基因真核穿梭载体构建 |
| 2.2 双基因共表达真核穿梭载体构建 |
| 2.3 重组Bacmid的筛选与鉴定 |
| 2.4 重组BacMid质粒提取 |
| 2.5 质粒浓度测定 |
| 2.6 Sf9细胞的培养 |
| 2.7 细胞病变情况观察 |
| 2.8 重组杆状病毒的DNA鉴定 |
| 2.9 目的蛋白表达的位置检测 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 转座过程中筛选效率 |
| 3.2 昆虫Sf9细胞培养 |
| 3.3 Sf9细胞的转染效率分析 |
| 3.4 眼镜蛇CT蛋白的分子大小分析 |
| 3.5 目的蛋白的表达量分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 CT和PLA_2蛋白的纯化和镇痛活性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 2.2 蛋白定量 |
| 2.3 各组的扭体次数 |
| 3 讨论和小结 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）广西眼镜蛇神经毒素的原核表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 血液总DNA的抽提 |
| 1.2.2 CT基因的拼接PCR扩增 |
| 1.2.3 原核表达载体的构建和诱导表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CT基因成熟肽序列的扩增和分析 |
| 2.2 pET30a(+)-CT融合蛋白的表达 |
| 3 结语 |
（6）蛇毒蛋白基因克隆与高效表达的研究进展（论文提纲范文）
| 1 蛇毒蛋白目的基因的获取 |
| 1.1 从cDNA文库中获得目的基因 |
| 1.2 逆转录PCR技术克隆目的基因 |
| 1.3 化学合成获得目的基因 |
| 2 高效的表达载体的选择 |
| 3 表达条件的优化 |
| 3.1 细菌生长状态 |
| 3.2 宿主菌 |
| 3.3 诱导剂 |
| 3.4 诱导温度和时间 |
| 3.5 培养基 |
| 4 目的蛋白纯化 |
| 5 鉴定目的蛋白 |
| 6 结束语 |
（7）眼镜王蛇咬伤的临床特点及抗蛇毒血清治疗效果分析（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| 1、中文摘要 |
| 2、英文摘要 |
| 二、论文 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 5、结论 |
| 6、参考文献 |
| 三、综述 |
| 1、眼镜王蛇咬伤的中毒机理与治疗的研究进展 |
| 2、参考文献 |
| 四、致谢 |
（8）舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆、表达及免疫学活性鉴定（论文提纲范文）
| 论文部分 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写索引 |
| 综述 |
| 蛇毒蛋白基因克隆与高效表达的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）广西眼镜蛇毒中NGF和Natrin的分子生物学及性质研究（论文提纲范文）
| 主要中英文缩写 |
| 第一部分 广西眼镜蛇毒中神经生长因子的分子生物学研究 |
| 第一部分中文摘要 |
| 第一部分英文摘要 |
| 第一篇 广西眼镜蛇毒中NGF的克隆及序列分析 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验步骤与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 第二篇 广西眼镜蛇毒中NGF在E.coli中的的表达 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验步骤与方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 第三篇 广西眼镜蛇毒中NGF诱导人类小涎腺腺样囊性癌细胞株凋亡的作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 实验步骤和方法 |
| 3 结果和讨论 |
| 第一部分小结 |
| 第一部分实验参考文献 |
| 第一部分综述 |
| 第一部分综述参考文献 |
| 第二部分 广西眼镜蛇毒中Natrin的分子生物学及性质研究 |
| 第二部分中文摘要 |
| 第二部分英文摘要 |
| 第一篇 广西眼镜蛇毒中Natrin的分离和纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 第二篇 广西眼镜蛇毒中Natrin的克隆及在E.coli中的表达 |
| 1. 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三篇 广西眼镜蛇毒蛋白Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四篇 广西眼镜蛇毒蛋白Natrin对胃癌MGC-803细胞的凋亡作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分小结 |
| 第二部分实验参考文献 |
| 第二部分综述 |
| 第二部分综述参考文献 |
| 攻读博士期间已发表的文章 |
| 致谢 |
（10）眼镜王蛇三指毒素新基因的克隆、表达及重组长链神经毒素的功能研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 简介 |
| 2 神经毒素 |
| 3 心脏毒素 |
| 4 三指毒素的进化关系 |
| 第二部分 眼镜王蛇中6种三指毒素新基因的克隆及其进化关系分析 |
| 1 材料及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 眼镜王蛇中三指毒素的表达、纯化及鉴定 |
| 1 材料及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 重组长链神经毒素(rLNTX1与rLNTX3)的功能研究 |
| 1 材料及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验总结 |
| 发表论文情况 |
四、中华眼镜蛇神经毒素cDNA的克隆及表达(英文)（论文参考文献）
- [1]中华眼镜蛇咬伤中毒兔模型建立及其抗蛇毒血清作用时效性的研究[D]. 王璠. 广西医科大学, 2019(08)
- [2]银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定[D]. 胡玲玲. 南京师范大学, 2017(01)
- [3]广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测[D]. 鄢航. 广西大学, 2013(03)
- [4]广西眼镜蛇神经毒素的原核表达[A]. 鄢航,杨秀荣,邓继贤,郭亚芬,兰干球,蒋钦杨,蒋和生. 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集, 2012
- [5]广西眼镜蛇神经毒素的原核表达[J]. 鄢航,杨秀荣,邓继贤,郭亚芬,兰干球,蒋钦杨,蒋和生. 广东农业科学, 2012(10)
- [6]蛇毒蛋白基因克隆与高效表达的研究进展[J]. 陈瑜,许云禄. 海峡药学, 2009(05)
- [7]眼镜王蛇咬伤的临床特点及抗蛇毒血清治疗效果分析[D]. 林起庆. 广西医科大学, 2009(10)
- [8]舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆、表达及免疫学活性鉴定[D]. 陈瑜. 福建医科大学, 2009(S2)
- [9]广西眼镜蛇毒中NGF和Natrin的分子生物学及性质研究[D]. 宋慧. 广西医科大学, 2007(10)
- [10]眼镜王蛇三指毒素新基因的克隆、表达及重组长链神经毒素的功能研究[D]. 李晶. 中国科学技术大学, 2006(04)