一、无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响（论文文献综述）
姜璘[1]（2021）在《氯化锰对小鼠精原干细胞的损伤及机制研究》文中研究表明目的:通过对体外培养的小鼠精原干细胞给予氯化锰干预,探讨氯化锰对体外培养精原干细胞造成损伤的分子机制。方法:1.体外培养DBA系小鼠精原干细胞,按照0、25、40、50μmol/ml的浓度进行氯化锰干预,对照组精原干细胞不做任何处理,观察SSCs的增殖情况。2.MTT法检测不同浓度氯化锰干预后SSCs的增殖情况。3.Brd U法检测氯化锰干预后Brd U阳性细胞变化情况。4.Hochest法检测氯化锰干预后SSCs细胞周期变化情况。5.RT-qPCR技术检测精原干细胞干性维持基因MVH、PLZF、Pou5f1、GFRa1以及细胞周期相关基因Ccnd1、Ccnd2以及Ccne的mRNA表达情况。6.Western blot检测SSCs干性维持、细胞周期及凋亡相关蛋白表达情况。7.RNA-seq技术分析氯化锰干预后SSCs转录组水平变化情况。结果:1.氯化锰处理后导致SSCs增殖减缓。MTT法结果显示在25、40、50μmol/ml浓度的氯化锰干预3d后,SSCs增殖明显减缓（P<0.01）,且细胞数量显着减少（P<0.01）。且细胞增殖减缓的程度随氯化锰剂量增加而逐渐加重。2.根据MTT法实验结果,选取30μmol/ml氯化锰干预SSCs 3d后,Hochest染色后进行细胞流式分析。结果显示,与对照组相比,氯化锰干预后导致G0/G1期细胞显着增加（P<0.01）,在S期SSCs的数量显着减少（P<0.01）。表明氯化锰干预后SSCs的细胞周期被阻滞在G0/G1期。氯化锰干预SSCs后细胞增殖减少可能是由于细胞周期异常调控导致的。3.氯化锰干预后对SSCs干性相关基因MVH、Plzf、Pou5f1、GFRa1以及细胞周期相关基因Ccnd1、Ccnd2以及Ccne mRNA的表达影响。结果显示与对照组相比,30μmol/ml氯化锰干预后的SSCs,干性相关基因MVH、Pou5f1、GFRa1 mRNA表达显着降低（P<0.01）,Plzf mRNA表达降低（P<0.05）。细胞周期相关基因Ccnd1、Ccnd2以及Ccne mRNA表达显着降低（P<0.01）。4.氯化锰处理后对SSCs分化、周期以及凋亡相关蛋白的表达影响:与对照组相比,30μmol/ml氯化锰干预后,分化型SSCs标记蛋白C-Kit表达显着降低（P<0.01）,未分化精原干细胞的标记蛋白GFRa1、Plzf表达显着降低（P<0.01）,细胞周期相关蛋白Ccnd2以及Ccne表达显着降低（P<0.01）。5.RNA-seq结果表明,与对照组相比,30μmol/ml氯化锰干预后,有418个基因的表达显着上调、262个基因的表达显着下调。差异基因主要富集于氧化应激等生物学过程中。KEGG通路分析发现HIF-1通路等信号通路发生改变。结论:1.氯化锰干预后SSCs细胞周期被阻滞在G0/G1期,处于S期的SSCs减少。2.通过降低SSCs干性相关基因Plzf、GFRa1的表达,影响SSCs的干性。细胞周期相关蛋白CCND家族表达下降导致SSCs细胞周期出现紊乱。3.RNA-seq结果显示氯化锰干预后SSCs基因表达出现差异,信号通路出现改变。其中一些SSCs干性相关基因表达降低,以及通路的改变都导致了SSCs增殖的降低。
王婷[2]（2021）在《原代大鼠海马神经元中Sema3F对CREBBP基因及转录水平影响的相关性研究》文中研究说明
刘丹丹[3]（2021）在《基于定量化学蛋白质组学研究雷公藤红素抗缺血性脑卒中的靶点》文中指出实验目的:本研究从细胞水平和动物水平,基于合成的雷公藤红素探针（celastrol-prob,cel-p）,联合串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记、细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）、免疫荧光（immunofluorescence,IF）、蛋白免疫印迹（western blotting,WB）等实验技术研究了活性天然产物雷公藤红素（celastrol,cel）对体内外脑缺血再灌注（ischemic-reperfusion,I/R）损伤的神经保护作用,并探索了其可能的靶点及机制,为合理开发利用天然产物celastrol提供了有力的科学支撑。实验方法:细胞水平1.提取原代新生Sprague-Dawley大鼠皮层神经元细胞体外培养并通过IF方法检测其纯度。建立原代神经元细胞氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）模型体外模拟脑I/R损伤,并用cell counting kit-8（CCK-8）方法确立OGD模型的最佳造模时间。采用CCK-8方法确认celastrol及合成的cel-p对神经元细胞的半数抑制浓度（50%inhibiting concentration,IC50）、是否具有体外神经保护性、最佳给药剂量及给药时间。2.采用 SDS polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）凝胶电泳方法,研究cel-p对原代神经元细胞的蛋白质组反应谱和生物结合效率,并验证是否与母体化合物celastrol竞争性结合位点相同。采用IF和cel-p点击化学（click chemistry reaction）实验方法,研究cel-p在原代神经元细胞中随时间的定位。3.基于TMT标记,采用亲和标签的pull-down实验和液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS）的实验方法检测 cel-p在原代神经元细胞上结合的以及被竞争掉的靶蛋白。对cel-p结合的靶蛋白进行分析,分析celastrol作用于原代神经元细胞发挥神经保护性的可能靶点。4.根据分析结果,选取可信度较高的HMGB1蛋白进行验证。采用pull-down及SDS-PAGE凝胶电泳方法,研究celastrol是否可以与cel-p竞争性结合HMGB1蛋白。采用CETSA实验,研究celastrol是否可以增强HMGB1蛋白的热稳定性。5.采用WB和IF实验方法,研究建立原代神经元OGD模型后,celastrol对HMGB1、HSP70和NF-κB p65蛋白表达的影响。通过检测细胞培养上清中的HMGB1蛋白,研究模型组HMGB1蛋白随时间延长分泌的变化以及celastrol对HMGB1蛋白的分泌量的影响。6.采用重组人HMGB1、HMGB1 A box和B box蛋白,结合SDS-PAGE凝胶电泳方法和click chemistry reaction研究cel-p是否结合了 HMGB1蛋白的半胱氨酸位点。cel-p 是否减少了 B box 与 Toll 样受体 4（Toll like receptor4,TLR4）、晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）的结合,从而使其失去致炎作用。cel-p是否通过结合HMGB1蛋白抑制了其升高小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7细胞TNF-α分泌的能力。动物水平1.采用线栓法建立雄性成年Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉阻断（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型体内模拟脑I/R损伤,以依达拉奉注射剂（edaravone injection,eda,6 mg/kg）为阳性对照,确认 celastrol（1 mg/kg）是否具有体内神经保护性。在MCAO模型1.5 h后拔出线栓进行再灌注,再灌注后Sham组及Model组腹腔注射1 mL生理盐水,M+cel组腹腔注射celastrol（lmg/kg）,M+eda 组尾静脉注射 edaravone（6 mg/kg）,然后分别于 24 h、48 h各给药一次,共三次。24 h、48 h、72 h进行Zea-Longa法行为学评分,72 h后取出大鼠脑组织进行 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色。2.在72 h后,每组取四只大鼠,经PBS、4%多聚甲醛灌流后取脑组织进行脱水、石蜡包埋,切片后对皮层组织神经元进行尼氏染色分析,对HMGB1、HSP70和NF-κB p65蛋白进行IF分析。每组取四只大鼠,分离患侧大脑中皮层组织对HMGB1、HSP70和NF-κB p65蛋白进行WB分析,进一步体内验证celastrol发挥神经保护性的靶点和机制。实验结果:细胞水平1.提取的原代神经元细胞纯度大于90%,可用于其他的实验研究。CCK-8方法确立OGD模型的最佳造模时间为缺糖缺氧4 h,celastrol与cel-p的IC50相近（celastrol IC50=2.06±0.52 μM,cel-p IC50=2.24±0.59 μM）,均具有明显的神经保护性。最佳给药剂量为0.1-0.8 μM,最佳给药时间为OGD模型后立即连续给药48 h。因此,合成的cel-p与母体化合物celastrol具有等效性,可代替原药用于后续靶点研究。2.采用SDS-PAGE凝胶电泳方法证实,对于原代神经元细胞,cel-p具有较高的生物结合效率,在低至0.8μM浓度下产生明显可见的条带,并与原药celastrol 8 ×（6.4 μM）竞争条件下具有相同的结合位点。采用IF方法和click chemistry reaction实验证实,cel-p可以在4 h内从细胞胞浆进入胞核,因此可用于标记胞浆和胞核的蛋白。3.采用TMT标记、pull-down和LC-MS/MS的方法检测cel-p在原代神经元细胞上结合的以及被竞争掉的靶蛋白。对cel-p结合的靶蛋白进行分析,发现共鉴定蛋白1405个,其中为高可信度的蛋白120个。4.根据分析结果,选取可信度较高的HMGB1蛋白进行验证。采用pull-down及SDS-PAGE凝胶电泳方法,证实celastrol可以与cel-p竞争性结合HMGB1蛋白,因此可进一步展开生物学实验以探究celastrol在细胞水平的作用靶点。采用CETSA实验,证实celastrol与HMGB1结合明显增强了 HMGB1的热稳定性。5.采用WB实验方法,证实建立原代神经元细胞OGD模型后,celastrol不能影响HMGB1的整体表达以及胞浆胞核的表达,明显升高了 HSP70的表达,降低了 NF-κB p65的表达。采用IF技术,证实cel-p与HMGB1蛋白具有共定位现象,对HMGB1、HSP70、NF-κB p65的影响趋势与WB结果一致。通过检测OGD模型组细胞培养上清中的HMGB1蛋白发现,模型组HMGB1蛋白随时间延长逐渐分泌出去到培养基中,在24 h以后达到高峰。而celastrol在OGD模型后给药48 h并没有减少培养基中HMGB1蛋白的分泌量。由以上结论我们推测,celastrol可能无法影响HMGB1蛋白的出入核和分泌,而是通过直接结合HMGB1蛋白使其失去致炎活性。6.采用重组人HMGB1蛋白,证实cel-p可以结合HMGB1蛋白,并且可以竞争性抑制已知的HMGB1蛋白抑制剂（甘草次酸、二甲双胍）与HMGB1的结合。N-Hex-5-ynyl-2-iodoacetamide（IAA-yne）与二硫键型 HMGB1 蛋白的结合可以被celastrol几乎全部抑制,用Dithiothreitol（DTT）还原HMGB1二硫键后,celastrol同样可以几乎全部抑制IAA-yne与HMGB1蛋白的结合。由此可知,celastrol可以结合二硫键型HMGB1蛋白的106位半胱氨酸,也可以结合全还原型HMGB1蛋白的23、45、106位半胱氨酸。采用重组人A box和B box蛋白,证实cel-p与Abox、B box的结合几乎不能被2-iodoacetamide（IAA）抑制,而IAA-yne与A box、B box的结合可以被celastrol几乎全部抑制。因此,celastrol除了结合HMGB1蛋白的半胱氨酸,还有其他的结合位点。Celastrol明显抑制了HMGB1引起的RAW 264.7细胞TNF-α分泌。此外,celastrol可明显抑制HMGB1 B box与TLR4、RAGE受体的结合,因此使其失去致炎活性。动物水平1.各组大鼠在MCAO后72 h进行TTC染色病理学分析显示,M+cel和M+eda组的大鼠脑组织损伤侧梗死体积相较于Model组显着降低（p<0.05）。神经功能缺损评分（Zea-Longa）显示,M+cel和M+eda的大鼠在MCAO 24 h、48 h和72 h时间点均显着降低神经功能缺损评分,改善运动功能和行为。因此,TTC染色、Zea-Longa法行为学评分结果表明,celastrol 1 mg/kg体内同样具有神经保护性。2.尼氏染色结果显示,相较于Model组大鼠,M+cel和M+eda组大鼠皮层神经元细胞尼氏小体数量显着增多,排列紧密。WB和IF实验结果表明,celastrol几乎不能影响HMGB1的表达水平,但是明显升高了 HSP70的表达,降低了 NF-κB p65,结果与体外实验趋势一致。因此,celastrol通过作用于HSP70和NF-κB p65在体内发挥抗炎作用和神经保护性。结论:由以上可知,celastrol对体内外脑缺血再灌注损伤均具有明显的神经保护性,一是通过直接结合HMGB1蛋白,使其不能与TLR4、RAGE受体结合,从而失去致炎作用,二是提高细胞或者组织HSP70的表达,降低NF-κB p65的表达而发挥抗炎作用。
史晋朝[4]（2021）在《EphA4受体对糖氧剥夺/复氧大鼠海马神经元Bdnf表达影响的研究》文中研究说明目的:1.建立一种适宜的海马神经元体外培养方法,以及海马神经元糖氧剥夺/复氧模型。2.通过建立糖氧剥夺/复氧模型,探究EphA4受体对脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）及前体BDNF（pro-BDNF）表达的影响。方法:1.原代海马神经元体外培养实验。采用雌雄不限1-3d的SD型大鼠乳鼠,将其海马组织分离,培养海马原代神经元。将神经元随机分为胶质细胞完全抑制组、不完全抑制组和不抑制组。培养7d后,按照神经元生长情况,选取最合适的培养条件进行后续的神经元培养。2.糖氧剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型制备。Control组在正常细胞培养箱的中继续培养;OGD/R组在缺氧缺糖环境中进行处理,分为9组,糖氧剥夺0.5、1.0和1.5h后再复氧24h,36h和48h,具体分为:OGD0.5h/R24h组、OGD0.5h/R36h组、OGD0.5h/R48h组、OGD1h/R24h组、OGD1h/R36h组、OGD1h/R48h组、OGD1.5h/R24h组、OGD1.5h/R36h组和OGD1.5h/R48h组。按照神经元损伤程度和存活率选取最合适的OGD/R条件用于后续实验。3.CCK-8法检测神经元存活率。将海马神经元接种到96孔培养板上,分为OGD0.5h/R24h组、OGD0.5h/R36h组、OGD0.5h/R48h组、OGD1h/R24h组、OGD1h/R36h组、OGD1h/R48h组、OGD1.5h/R24h组、OGD1.5h/R36h组和OGD1.5h/R48h组,每组设置3个复孔,每孔100μl培养体系,细胞约为6×103个/孔。培养7天,OGD/R处理每组的对应时间,每孔加入10μl CCK-8溶液。37℃保持温度恒定,孵育4h。450nm测定吸光度值。4.乳酸脱氢酶（LDH）测定神经元活力。根据神经元各组缺氧复氧完成时间,收集其培养液,检测各组海马神经元培养液中乳酸脱氢酶的含量。450nm测定吸光度值。5.根据实验结果,在后续实验中选取OGD1h/R36h作为模型组。6.EphA4-Fc拮抗EphA4受体功能。将配好的EphA4-Fc溶液加入神经元培养液中,神经元培养液内EphA4-Fc浓度保持在4μg/ml。每次换液,重新加入EphA4-Fc溶液,保证培养液内EphA4-Fc浓度恒定。7.应用Western blot技术检测pro-BDNF蛋白质和BDNF蛋白质。实验检测对照组、OGD/R处理、以及给予EphA4-Fc拮抗EphA4受体功能后,pro-BDNF蛋白和BDNF蛋白质的变化。8.应用RT-qPCR法检测BDNF m RNA的表达。将培养至成熟的原代海马神经元按照实验所需分组,做不同条件处理。共培养10d后,提取总RNA,设计BDNF多种启动子引物,运行RT-qPCR扩增程序。计算Bdnf基因转录本的相对表达量。结果:1.结果显示:培养神经元时如果不抑制胶质细胞的生长,由于胶质细胞分裂迅速,当神经元培养至第7天时,显微镜下难以观察到海马神经元的长势和状态,并且此条件下培养的神经元数量相对较少,神经元纯度较低。当完全抑制胶质细胞时,胶质细胞基本不生长,此时神经元数量较多,纯度可达95%以上。但此培养条件下的胶质细胞数量过少,更适用于膜片钳等实验技术。当部分抑制胶质细胞时,培养的海马神经元状态均一良好,胞体圆润呈三角型,边缘光滑,胶质细胞数量与海马神经元数量接近1:1,同时保留了胶质细胞与神经元间的信息交流。此培养条件更实用于本实验。2.采用常规方法培养海马神经元时,对其生长状态和形态进行观察。发现神经元长势良好,贴壁性强。神经元的树突粗壮而且较长,分布广泛,彼此交联,形成密集的网状结构。神经元的胞体呈椎体型,折光性较强。在对神经元糖氧剥夺0.5h后,光学显微镜下观察到神经元胞体肿胀膨大。对神经元糖氧剥夺1h后,神经元的树突变细而且变短,分布范围开始缩小。神经元的胞体更加膨大,并且折光性减弱。糖氧剥夺1.5h后,神经元在显微镜下开始有圆球状出现,这是由于神经元的树突断裂造成。神经元的贴壁能力减弱,开始出现聚集现象。此时的神经元容易从细胞板上脱离,部分细胞开始脱落。3.LDH和CCK-8的实验结果表明:OGD0.5h/R24h组、OGD0.5 h/R36h组和OGD0.5 h/R48h组LDH含量和细胞存活率相对于正常对照组无显着变化。OGD1h/R24h组和OGD1h/R36h组LDH含量和细胞存活率无显着差异,OGD1h/R48h组LDH含量显着升高,细胞存活率显着降低。OGD1.5h/R24h组和OGD1.5h/R48h组LDH含量显着升高,细胞存活率显着降低,OGD1.5h/R36h组LDH无显着变化,细胞存活率显着降低。4.Western blot结果显示:与对照组相比,OGD1h/R36h组pro-BDNF蛋白和BDNF蛋白达显着的降低。与OGD1h/R36组相比,OGD1h/R36h+EphA4-Fc组pro-BDNF蛋白表达和BDNF蛋白表达显着升高。5.RT-qPCR结果显示:与对照组相比,给予EphA4-Fc后,包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本的表达显着降低。与对照组相比,OGD1h/R36h组包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本的表达显着升高。与OGD1h/R36h组相比,OGD1h/R36h+EphA4-Fc组包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本的表达显着降低。包含外显子IIc的Bdnf基因转录本表达在各组均无显着变化。结论:1.不完全抑制胶质细胞生长时,原代培养海马神经元长势良好,结果易于观察。2.OGD1h/R36h后,神经元树突缩短变细,神经元之间连接的网状结构被破坏,变稀疏,神经元活力降低,但存活率较高,利于后续实验的进行。3.OGD1h/R36h后,海马神经元pro-BDNF蛋白和BDNF蛋白表达降低与包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本表达升高相关。拮抗EphA4受体功能引起的pro-BDNF和BDNF蛋白表达增加,与包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本表达降低相关。
赵琦琦[5]（2021）在《OTUD3对神经干细胞增殖和分化影响的研究》文中研究指明
司誉豪[6]（2021）在《龟鹿二仙胶经成骨细胞来源外泌体抗骨质疏松的作用与机制研究》文中提出背景:骨质疏松症发病的根本机制在于成骨—破骨细胞交互的骨稳态失衡。中医“阴阳平衡”理论与成骨—破骨细胞间的骨稳态平衡具有极其微妙的关联性。课题组前期探索在成骨细胞机制的基础上,对龟鹿二仙胶影响成骨—破骨细胞信号交互的机制展开探索,发现其机制包括:①上调TGF-β/Smads信号通路中TGF-β、Smad3、P-smad3的表达。②激活MMP3-OPN-MAPK通路,平衡成骨—破骨细胞之间的耦联。进一步的研究发现,外泌体包裹并传递信号分子,是成骨—破骨细胞间交互的主要中介因素。目的:优化外泌体制备技术;从离体与在体实验分别验证龟鹿二仙胶干预后的成骨细胞来源外泌体对成果-破骨细胞的影响,从骨代谢指标、骨密度、骨微结构、生物力学等方面,通过PRM与PCR技术揭示龟鹿二仙胶通过外泌体途径调控TGF-β/Smads信号通路及破骨分化信号通路起抗骨质疏松的作用机制,为阐明中医“阴阳平衡”理论指导下的骨稳态平衡调节机制提供实验基础。方法:①原代成骨细胞体外提取技术优化:针对原代成骨细胞提取效率低下的问题,通过优化提取步骤,以提高成骨细胞提取与培养效率,采用ALP与茜素红染色鉴定成骨细胞。②成骨细胞源性外泌体制备与验证:使用超速离心法制备去外泌体血清与分离成骨细胞来源外泌体,通过透射电镜、NTA、Western Blot验证外泌体制备成功。③GEG-OB-EV对去势大鼠骨质疏松模型的作用与机制:切除大鼠双侧卵巢以建立骨质疏松模型,分为生理盐水组（NS）、模型组（OVX）、阿仑膦酸钠组（ALN）、OB-EV组（OB-EV）、GEG-OB-EV 组（GEG-OB-EV）。通过 CCK-8 法确定 GEG 对 OB 的最佳给药浓度,使用ELISA技术检测血清骨代谢指标,Micro-CT观察骨微观结构改变,HE染色观察骨组织病理学变化,三点弯折试验测试骨组织生物力学性能,PRM与RT-PCR技术检测TGF-β与RANK/RANKL/OPG信号通路中相关指标的蛋白与mRNA表达变化。④GEG-Mc3t3-EV对RAW264.7诱导破骨细胞的影响:建立Mc3t3-E1与RAW264.7培养体系,采用RANKL与M-CSF诱导RAW264.7为破骨细胞作为干预对象,分为空白对照组（BC）、外泌体抑制组（GW4869）、GEG含药血清组（GEG）、Mc3t3-EV组（Mc3t3-EV）、GEG-Mc3t3-EV 组（GEG-Mc3t3-EV）、阿仑膦酸钠组（ALN）。通过 EDU 法确定GEG对Mc3t3-E1的最佳给药浓度,通过transwell小室与PKH26标记EV评估RAW264.7对Mc3t3-EV摄取情况,使用流式细胞术评价RAW264.7凋亡情况,采用TRAP染色半定量、骨吸收板、RT-PCR等技术评价破骨细胞分化与功能情况。结果:①原代成骨细胞体外提取技术优化:对传统二次酶消化法进行改良,将原先操作难度高、操作时间长的剥除骨面多余组织替代为振荡涡旋冲洗,将剪碎块步骤替代为50mL离心管内批量剪碎,使成骨细胞提取效率大大提高,且ALP与茜素红染色鉴定无误。②成骨细胞源性外泌体制备与验证:OB-EV透射电镜图像显示,EV形态完整、近似球形、大小较为均一,平均粒径为74.75nm,30～150nm颗粒占比为97.66%,颗粒浓度为1.67*109个/mL。OB-EV经BCA定量浓度约为1.106±0.082μg/μL,标记蛋白CD63、CD9、TSG101均呈阳性,而Calnexin呈阴性。③GEG-OB-EV对去势大鼠骨质疏松模型的作用与机制:CCK-8结果显示24h10%GEG含药血清培养的OB活性最接近正常生长状态。体重:造模12周后,OVX组、ALN组、GEG-OB-EV组、OB-EV组大鼠体重在0-2周时有一个较为明显上升,随后趋于平缓,四组之间体重变化上没有显着差异（P>0.05）,而四组较NS组大鼠体重有明显增加,差异具有显着统计学意义（P<0.05）;血清骨代谢指标:与NS组比较,OVX组的雌激素（estrogen,E）、Pi、OPG显着下降,ALP、TRACP、β-CTX、PINP明显上升,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。与OVX组比较,GEG-OB-EV可明显提高血清Pi、OPG、E,抑制血清ALP、TRACP、β-CTX、PINP水平,差异具有显着统计学意义（P<0.05）;Micro-CT:三维建模分析结果表明,OVX组骨小梁丢失十分明显,GEG-OB-EV、OB-EV与ALN组骨小梁较OVX组有显着改善,其中GEG-OB-EV与ALN组改善更为明显,但仍不如NS组。与NS组比较,OVX组的BV/TV、Tb.N、BMD、Tb.Th均有显着下降,但Tb.SP显着上升,差异均具有显着统计学意义（P<0.01）。相较于OVX组,GEG-OB-EV组的BV/TV、Tb.N、BMD、Tb.Th均有明显上升,Tb.SP显着下降,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。OB-EV、ALN组相较于OVX组也具有相似的结果（P<0.05）。HE染色:OVX组较NS组的骨小梁变细,间距增大,结构紊乱,有断裂现象。出现骨髓水肿,成骨细胞大量丢失,骨髓腔内骨细胞明显减少,脂肪细胞增多、增大明显。而GEG-OB-EV组较OVX组骨小梁结构有所改善,排列略整齐,骨细胞增多,脂肪细胞减少。相关分子机制结果:OVX组的RANKL、CTSK、MMP14、Atp6v0d2、NFATc1等表达较NS组均明显升高,在各药物干预后均有明显下降,其中GEG-OB-EV与ALN抑制作用最为明显,而GEG-OB-EV还可明显上调TGF-β/Smads信号通路中关键分子Smad3与TGF-β。④GEG-Mc3t3-EV对RAW264.7诱导破骨细胞的影响:EDU结果显示24h10%GEG含药血清培养的Mc3t3-E1的活性最佳;EV摄取结果:transwell小室显示,荧光标记的Mc3t3-E1细胞膜会分泌物质通过1μm孔径的滤膜进入下层,RAW264.7细胞膜上可见呈圆形或不规则型的荧光物质。PKH26-Mc3t3-EV直接加入RAW264.7中则见橙红色的PKH26-Mc3t3-EV紧紧围绕在蓝色的细胞核周围。TRAP染色及半定量分析:RAW264.7经RANKL及M-CSF诱导4-5d后可融合成体积较大的多核细胞,TRAP染色后呈不规则形或椭圆形,边界清晰。GEG-Mc3t3-EV可明显抑制RANKL及M-CSF诱导的破骨细胞分化,其效果明显优于Mc3t3-EV（P<0.05）。骨吸收功能:RAW264.7诱导后可见骨吸收板上出现明显呈圆形的骨吸收陷窝。GEG-Mc3t3-EV可明显减少破骨细胞形成的骨吸收陷窝数量,其效果与GEG含药血清相当,优于Mc3t3-EV,但弱于ALN,差异均具有统计学意义（P<0.05）。相关分子机制结果:与BC组比较,GEG-Mc3t3-EV组的c-FOS、CTSK、NFATC1、TRAP的mRNA表达量均有显着下降,且差异均具有显着统计学意义（P<0.05）。结论:龟鹿二仙胶可通过成骨细胞源性外泌体在动物体与细胞水平上发挥抗骨质疏松作用,其机制可能与上调TGF-β/Smads信号通路中Smad3与TGF-β以及抑制RANK/RANKL/OPG中NFATc1等转录和破骨特异因子有关,继而双向平衡成骨—破骨细胞之间的耦联,改善骨代谢、微观结构及生物力学性能。
周东蕊[7]（2021）在《血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究》文中提出研究目的:1.观察血塞通注射液对大鼠大脑中脉闭塞（MCAO）28天神经功能的影响,探究血塞通对损伤皮层LINGO-1,EGFR,PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。2.观察血塞通注射液对体外培养SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损伤的保护作用,验证血塞通注射液对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。研究方法:1.采用改良的Longa法对SD大鼠进行MCAO模型的制备,假手术组大鼠只进行皮肤切开以及钝性分离血管和神经,不插入栓线。大鼠MCAO模型的成功建立评价方法选用TTC染色法。2.根据术后Longa评分将手术组大鼠随机分为模型组,血塞通小剂量组,血塞通大剂量组和尼莫地平组（即阳性药物组）。假手术组和模型组注射同等剂量的生理盐水,其余组别给与相对应的药物治疗。术后1-28天,每日清晨给药前对大鼠进行称重,根据mNSS神经功能评分表进行评分。评价血塞通对大鼠MCAO术后不同时间点（7天,14天和28天）神经功能和体重恢复的疗效。MCAO术后28天,将所有大鼠麻醉后断头取脑,采用HE染色观察大鼠大脑皮层的病理变化,采用Western blot法检测皮层梗死侧的SYN和PSD-95的蛋白表达变化,探索血塞通注射液对皮层梗死区的神经保护作用。采用qRT-PCR、免疫组织化学（IHC）和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层LINGO-1,EGFR以及PI3K/AKT的mRNA和蛋白表达,探索血塞通的神经保护机制。3.采用qRT-PCR和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达,进一步探索血塞通的神经保护机制。4.体外培养SH-SY5Y细胞,CCK-8法确定最佳缺氧时间,建立OGD/R损伤SH-SY5Y细胞模型,CCK-8法确定血塞通和bpV的最适药物浓度。将SH-SY5Y细胞随机分为正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组等5个组别,按照不同组别给与相对应的药物,正常组给与无血清的EBSS液,模型组给与无糖的Earle’s液。镜下观察血塞通对OGD/R损伤SHSY-5Y细胞生长状态的影响。采用qRT-PCR和Western Blot检测OGD/R损伤SH-SY5Y细胞的PI3K/AKT以及PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达对体内实验进一步验证,观察当使用bpV时,PTEN及其下游的PI3K/AKT通路、GSK-3β mRNA和蛋白的表达情况。研究结果:1.TTC染色显示:假手术组大鼠右脑为均一的红色,表明脑组织并未损伤;手术组大鼠由于大脑右侧被梗塞而出现广泛的白色,表明MCAO可诱导大鼠右侧脑组织梗死。研究结果证明大鼠MCAO模型成功建立。2.各组大鼠的体重在造模前未见显着的差异（P>0.05）;在MCAO术后第7天和第14天,各组大鼠体重均明显低于假手术组（P<0.05或者P<0.01）;术后第28天,除模型组外,各药物治疗组大鼠的体重与假手术组没有明显差异（P>0.05）。术后第14天的假手术组大鼠的体重高于第7天假手术组的体重,余组别两个时间点比较未见明显差异（P>0.05）;而第28天各组大鼠的体重均显着高于第14天相同组别的大鼠（P<0.01）。手术组各组大鼠苏醒后EZ-Longa评分组间未见明显差异（P>0.05）。在第7天的mNSS评分中,血塞通大剂量组明显低于模型组（P<0.05）。药物治疗后14天,血塞通治疗组（包括小剂量和大剂量）和尼莫地平组大鼠的mNSS评分与模型组相比显着降低（P<0.05）。而药物治疗后28天,血塞通治疗组大鼠的mNSS评分与模型组相比明显降低（P<0.05或P<0.01）;血塞通大剂量组在降低大鼠的mNSS评分方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05）。这说明血塞通治疗可长期缓解MCAO大鼠的神经功能障碍,且具有剂量依赖性。MCAO术后相同组别的mNSS评分在不同时间点的比较显示:第7天和第14天同一组别的mNSS评分无显着差异（P>0.05）;除尼莫地平组外,第28天的mNSS评分显着高于同一组别第14天的mNSS评分（P<0.05）。MCAO术后28天,HE染色结果显示:假手术组大鼠的脑组织形态和细胞结构完整。模型组大鼠脑组织呈大面积损伤,组织着色较浅,神经细胞坏死、核固缩、深染;治疗组大鼠的脑组织也出现一定的损伤,但是和模型组相比,损伤程度较轻,神经细胞的数量也多;与血塞通小剂量组和尼莫地平组相比,血塞通大剂量组的脑组织结构更完整,神经细胞数量亦明显增多。MCAO术后28天,与模型组相比较,各治疗大鼠的PSD-95蛋白表达显着升高（P<0.01）;对各治疗进行比较发现,血塞通大剂量组在提高PSD-95表达方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05或P<0.01）。与模型组相比,血塞通大剂量组和尼莫地平组可显着提高大鼠大脑皮层SYN蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）;与血塞通小剂量组相比,血塞通大剂量组在提高SYN蛋白表达方面具有显着的优势（P<0.05）。MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:各组LINGO-1,EGFR,PI3K以及AKT mRNA表达无显着变化（P>0.05）。IHC结果显示:LINGO-1的阳性颜色为深棕色,假手术组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达较少;各治疗组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达显着低于模型组的阳性表达（P<0.01）;而对各治疗组之间皮层LINGO-1的阳性表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。各组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的阳性颜色均为深棕色,假手术组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT呈低表达;各治疗组大鼠大脑皮层P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达显着高于模型组（P<0.01）;对各治疗组之间的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:各治疗组大鼠的Lingo-1蛋白的相对表达相较于模型组显着下降（P<0.01）,接近正常水平;而各治疗组之间进行比较,Lingo-1的表达未见明显差异（P>0.05）。各治疗组的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT高于模型组（有趋势,或P<0.05,或P<0.01）;治疗组之间比较无明显差异（P>0.05）。3.MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:除血塞通大剂量组的大鼠脑组织的PTEN mRNA表达明显高于假手术组的mRNA（P<0.05）,其余各组大鼠脑组织的PTEN mRNA表达组间比较未见显着差异（P>0.05）;各组大鼠脑组织的GSK-3β mRNA表达组间亦未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:与模型组相比,各治疗组的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;而各治疗组之间的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白水平无明显差异（P>0.05）。4.CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的最佳缺氧时间为7 h;血塞通和bpV对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的最适药物浓度分别为20μg/ml和1μmol/L。通过镜下观察血塞通,bpV以及血塞通+bpV对OGD 7 h/R 24 h培养的SH-SY5Y细胞生长状态的影响发现,血塞通组、bpV组以及血塞通+bpV组的贴壁细胞数量较模型组多,大部分细胞呈多边形或梭形,部分细胞突触缩短,但大部分细胞突触仍存在,各治疗组之间的细胞形态未见明显的差异。SH-SY5Y细胞OGD 7h/R24 h培养后,qRT-PCR结果显示:正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组细胞的PI3K,AKT,PTEN和GSK-3β mRNA的水平未见显着差异（P>0.05）。Western blotting检测结果显示,与模型组相比,各治疗组大鼠大脑皮层的 P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN 以及 P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平显着升高（P<0.05,或P<0.01）;各治疗组之间的P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN以及P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平比较未见明显差异（P>0.05）。研究结论:1.血塞通可以长期缓解MCAO大鼠的脑组织损伤并促进神经重塑和再生从而增加MCAO术后大鼠的体重,改善MCAO大鼠的神经功能。2.血塞通发挥的神经保护作用机制包括抑制LINGO-1表达,激活EGFR和PI3K/AKT信号通路,抑制PTEN的表达进一步激活PI3K/AKT通路,从而抑制下游GSK-3β的活性,长期促进突触的重塑和再生。3.血塞通可以缓解OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,通过抑制PTEN的活性,激活其下游PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,发挥长期的神经保护作用。
杜颖珊[8]（2021）在《应用生理电场调控神经干细胞在体外构建小鼠三维工程化神经组织》文中研究表明目的:在体外使用Matrigel为三维（Three-dimensional,3D）支架材料、小鼠NSCs为种子细胞,通过生理电场的导向性作用,诱导神经分化和神经突起平行有序生长,构建小鼠3D工程化神经组织,并建立优化数据库,为工程化神经组织的产业化奠定实验基础。方法:以小鼠NSCs为种子细胞,以Matrigel为3D基质支架,通过150 m V/mm生理电场的调控作用,在体外构建工程化神经组织。本研究根据分化培养基的不同和是否施加电场刺激分为四组。分化培养基分为BNb培养体系（b FGF（20ng/ml）、B27（1:50）、N2（1:100））和10%FBS培养体系。分组如下:BNb加电组（BNb+EF）、BNb不加电组（BNb）、FBS加电组（FBS+EF）和FBS不加电组（FBS）。应用细胞凋亡检测技术、免疫荧光化学染色技术、电子显微镜技术以及图像分析法检测不同条件下构建的工程化神经组织中细胞的存活、凋亡、神经分化比率、神经细胞的形态、突起的长度以及突触和髓鞘的形成,建立基于生理电场诱导条件的小鼠3D工程化神经组织的优化培养体系。结果:（1）NSCs以不同细胞密度接种在不同厚度的Matrigel胶中培养7d,显微镜下观察细胞生长状态,以20个/mm3的密度接种于300μm厚度的Matrigel中的神经元及突起生长状态最佳。（2）根据细胞存活与凋亡检测结果显示,在150m V/mm的EFs下,每天施加EFs 1h,连续3d。EFs组仅有5.47%±0.74%的细胞死亡率。EF组与No EF组在细胞死亡率没有明显的差距。（3）Tuj1/GFAP免疫荧光双重染色结果显示,FBS组中,Tuj1阳性细胞的比率仅为6.21%±0.94%。当给予150 m V/mm的EFs刺激时,Tuj1阳性细胞的比率增加到74.80%±2.25%。（4）对神经突起长度的分析结果表明,FBS组的神经元突起仅为18.87±1.57μm（n=28）,FBS+EF组的神经元突起平均长度为42.6±4.37μm（n=36）,FBS组突起长度明显短于EF组。（5）BNb组的神经突起平均长度可达到47.55±2.29μm,这明显长于FBS组的突起长度（18.87±1.57μm）。施加电刺激后,神经突起的长度明显增加:在FBS+EF组,神经突起的平均长度为42.6±4.37μm;BNb+EF组中,神经突起长度达到67.13±3.11μm。（6）BNb组的神经元分化率与FBS+EF组的结果分别为60.2%±2.89%和74.8±2.25%,BNb组的细胞分化率低于FBS+EF组的。同时,BNb+EF组的Tuj1分化率达到了最高（82.2%±5.65%）。（7）Tuj1阳性细胞形态分析结果表明,Tuj1阳性细胞中包括椭圆形细胞、平行排列的细胞、具有短突起的神经元（<30μm）和具有长突起的神经元（≥30μm）等四种形态。统计各组不同形态细胞的所占比例:FBS+EF组中,平行排列细胞达31.47±5.18%。BNb组椭圆形细胞数量显着减少,为25.7±2.18%,而长突起神经元数量显着增加,为15.9±1.27%。在FBS组中,椭圆形细胞和长突起神经元的比例分别为92.4±4.58%和1.83±0.93%。在BNb+EF组中,长突起的神经元占57.1±4.3%。（8）电镜结果显示,在工程化神经组织培养14d后,可观察到典型的神经元。BNb+EF组中神经突起分支延伸到更广泛的区域。FBS组突起短小。此外,也观察到神经元的突触前膜和突触后膜厚度增加。培养21d后,BNb+EF组中神经元含有高度发达的粗面内质网、典型的突触结构以及髓鞘。结论:（1）150m V/mm的生理电场刺激对3D水凝胶支架中NSCs的存活率没有影响;（2）150m V/mm的生理电场刺激可以诱导3D水凝胶内的神经干细胞向神经元定向分化;（3）150m V/mm的生理电场刺激可以引导3D水凝胶内神经突起的平行长向生长;（4）碱性成纤维细胞生长因子（b FGF）的协同作用进一步促进了神经突起的长向生长;（5）生理电场诱导的工程神经组织内形成了具有大量突触和髓鞘的神经网络。
刘鹏[9]（2021）在《含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究》文中研究指明由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
刘学磊[10]（2021）在《仿生电磁场在癌症及糖尿病治疗中的应用研究》文中提出癌症与糖尿病在国内外都有着很高的发病率,已经成为全球严重的公共卫生问题,严重威胁着人民的健康,给患者及其家庭造成了沉重的负担。目前,主流的癌症治疗手段包括化学疗法、放射疗法和外科手术。这些传统的治疗方法不但会引起诸多的副作用,还常常伴随着较高的复发率;另一方面,目前治疗II型糖尿病（T2DM）主要依赖改善生活习惯,使用降糖药,以及补充外源性胰岛素的方法控制病情进展。但是,治疗效果并不理想,只有一半接受治疗的患者血糖水平得到了有效控制。随着电力工业的发展,电磁场的生物效应越来越受到人们的关注。1979年,Wertheimer调查了超高压电站对儿童白血病发病率的影响。由此开启了近代生物电磁学的研究高潮。早期的研究者更多地关注人工电磁场对人体健康的负面影响,为电磁场阈值的制定提供科学依据。近年来,越来越多积极的电磁场生物效应被研究者们所发现,包括电磁场对癌症、糖尿病、神经系统疾病、免疫系统疾病、皮肤伤口愈合、肌肉骨骼系统疾病等疾病的治疗作用以及抗氧化等健康增强功能。与传统的疾病治疗手段相比较,电磁治疗还具有安全、无痛、无创、无副作用等优点。电磁治疗方法还处于发展的初期,虽然具有诸多的优势,同时也存在一些明显的问题。例如:1)生物电磁效应机制尚未明确;2)存在许多不能成功复现甚至相互冲突的实验结果;3)治疗用电磁场参数选择的盲目性。这些问题的存在阻碍了电磁治疗方法在临床上的应用。虽然已经有多个生物电磁效应机制被提出,如:自由基对理论、生物化学热力学模型、离子振荡模型等,但这些理论仍然在遭受质疑,没有被证实。生命系统的复杂性以及生物学和物理学之间的巨大鸿沟,限制了对磁接收机理的研究进展。生物电磁效应机制研究的突破有赖于生物物理学和相关技术的发展。存在许多不能成功复现甚至相互冲突的实验结果,这是生物电磁学领域一个非常突出的问题。通过文献调研发现,虽然方向性是电磁场等矢量场的一个重要特征,非常多的研究却忽视了电磁场方向性对生物电磁效应的影响。本文以细胞内ATP水平为检测指标,考察了竖直、水平以及倾斜方向电磁场的影响。实验结果证实了电磁场的生物效应具有方向性。这为早期互相冲突研究文献的校验以及未来生物电磁效应研究实验的开展提供了非常有价值的指导。在电磁治疗中,选择合适的电磁场参数（包括频率、强度、波形等）是非常关键的一步。然而,在缺乏明确生物电磁效应机制的情况下,大多数研究只能随意地选取这些参数,这导致很差的治疗效果以及很长的实验周期。在这种情况下,本文提出使用仿生学方法来指导疾病治疗用电磁场参数的选择。仿生学是一种从自然界获取灵感,用于指导人类生活和工业生产的方法学。人类在一个充满了电磁场（如地球磁场、舒曼共振等）的自然环境中生存、进化,已经适应了地球上的自然电磁环境。有研究表明,自然电磁场有利于人体健康,甚至能够辅助某些疾病的治疗。因此,本文提倡模拟自然电磁场的参数来设计人造电磁场,用于疾病的治疗,并把这种模拟自然电磁场设计的人造电磁场叫做仿生电磁场（Bioinspired electromagnetic field,BIEMF）。本文选择了Magna Field（?）作为试验研究的BIEMF发射仪器。其可以发射强度与地球磁场相当,频率与大多数自然电磁场相近的仿生电磁场。首先,利用结晶紫染色实验,证实了0.5 Hz BIEMF具有抑制宫颈癌细胞（Hela）增殖的能力。当细胞密度增高到一定程度,BIEMF对Hela细胞的增殖抑制作用消失。对BIEMF抑制Hela细胞增殖机理的初步研究发现BIEMF似乎通过干扰细胞有丝分裂及触发细胞凋亡抑制Hela细胞的增殖。然后,通过细胞实验,发现在高葡萄糖浓度培养条件下,10 Hz BIEMF能够促进肝癌细胞对葡萄糖的吸收,而不影响细胞的数目。并且,BIEMF结合降糖药物联合使用,比BIEMF单独使用具有更加显着的促葡萄糖吸收效果。这表明10 Hz BIEMF具有治疗Ⅱ型糖尿病的潜力。通过以上细胞实验,本文验证了BIEMF确实具有治疗癌症及T2DM的潜力。这证实了仿生学方法应用于疾病治疗电磁场参数选择的可行性。为了将BIEMF更好地应用于临床治疗,本文设计了一款可穿戴的BIEMF发射端。在本文中BIEMF发射端被设计成了硬币大小的独立单元体,实际治疗时,多个发射端组合使用。经ANSYS Maxwell软件仿真计算,所设计扁平空心圆环状电磁场发射线圈的最佳尺寸为:厚度3 mm,内径4 mm,外径10 mm。相较于矩阵形排列的电磁场发射端,按照蜂窝状排列方式组合的发射端所发射的磁场强度更为均匀。最后,通过制作BIEMF发射端实物和搭建BIEMF发射系统,实际检测的磁场强度结果与仿真结果基本一致。论文的最后,为了研究BIEMF是否能够穿透各层人体组织到达靶组织或者靶器官,进行了理论及仿真研究。首先,利用Creo软件建立了人体上腹部及肝脏的三维模型,然后利用ANSYS Maxwell软件模拟了10 Hz BIEMF对人体腹部组织的穿透情况。经理论分析及ANSYS Maxwell软件仿真计算,所设计按照蜂窝状排列的扁平圆环状BIEMF发射端所发射的BIEMF能够顺利穿透人体腹壁各组织,并且在肝脏内形成了较为均匀的电磁场分布区域,实现了最初的设计要求,证明其具备作为可穿戴BIEMF治疗仪发射端的能力。
二、无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响（论文提纲范文）
（1）氯化锰对小鼠精原干细胞的损伤及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化锰造成雄性生殖损伤的分子机制研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）基于定量化学蛋白质组学研究雷公藤红素抗缺血性脑卒中的靶点（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 文献综述 雷公藤红素对神经退行性疾病的神经保护作用及主要作用机制 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验一 celastrol发挥体外神经保护作用的靶点和通路 |
| 第一节 celastrol及cel-p的体外神经保护性初步探索 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 新生大鼠原代皮层神经元细胞提取 |
| 1.2.2 定期显微镜下观察神经元形态 |
| 1.2.3 IF鉴定大鼠原代皮层神经元特异性及纯度 |
| 1.2.4 神经元OGD模型条件摸索 |
| 1.2.5 CCK-8法确定celastrol及cel-p的IC_(50) |
| 1.2.6 celastrol及cel-p是否具有体外神经保护作用 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 cel-p具有较高的蛋白标记效率 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 cel-p蛋白标记效率探究 |
| 1.2.3 click chemistry reaction及SDS-PAGE凝胶分离 |
| 1.2.4 cel-p细胞成像实验 |
| 1.2.5 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 TMT标记结合LC-MS/MS确认celastrol的靶蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 pull-down, TMT标记及LC-MS/MS分析 |
| 1.2.3 cel-p的靶标识别及验证 |
| 1.2.4 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四节 HMGB1是celastrol的直接结合靶蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 pull-down及WB实验对HMGB1进行验证 |
| 1.2.3 celastrol对HMGB1蛋白热稳定性的影响 |
| 1.2.4 click chemistry reaction荧光实验 |
| 1.2.5 高浓度celastrol和cel-p作用5h对HMGB1蛋白的影响 |
| 1.2.6 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五节 celastrol发挥神经保护性作用的通路 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 celastrol对正常神经元细胞HMGB1蛋白表达的影响 |
| 1.2.3 celastrol对OGD模型后HMGB1蛋白表达的影响 |
| 1.2.4 celastrol对神经元OGD模型HMGB1/HSP70/NF-κB p65的影响 |
| 1.2.5 IF实验观察celastrol对HMGB1、HSP70、NF-κB p65的影响 |
| 1.2.6 celastrol是否影响上清中HMGB1蛋白表达 |
| 1.2.7 celastrol是否影响HMGB1蛋白的氧化还原性 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六节 celastrol直接结合HMGB1和B box使其失活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 重组人A box及B box蛋白纯化及表达 |
| 1.2.3 重组人HMGB1蛋白与celastrol及cel-p反应 |
| 1.2.4 HMGB1抑制剂与cel-p的竞争性结合 |
| 1.2.5 重组人A box及B box蛋白与celastrol及cel-p反应 |
| 1.2.6 RAW 264.7细胞复苏、培养、传代、冻存 |
| 1.2.7 celastrol对HMGB1、B box引起的TNF-α分泌升高的影响 |
| 1.2.8 celastrol对B box与受体结合的影响 |
| 1.2.9 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 celastrol对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究 |
| 第一节 celastrol的体内药效初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物MCAO模型制备 |
| 1.2.2 实验动物分组及给药 |
| 1.2.3 Zea-Longa法评估动物的神经行为缺损 |
| 1.2.4 TTC染色观察大鼠的脑梗死情况 |
| 1.2.5 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 celastrol通过HMGB1,HSP70,NF-κB p65发挥体内神经保护性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物MCAO模型制备 |
| 1.2.2 实验动物分组及给药 |
| 1.2.3 大鼠灌流,取脑及脱水 |
| 1.2.4 尼氏染色观察celastrol对尼氏小体的影响 |
| 1.2.5 IF实验观察celastrol对HMGB1、HSP70、NF-κB p65的影响 |
| 1.2.6 WB检测大鼠中皮层HMGB1、HSP70、NF-κB p65表达 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的成果 |
| 致谢 |
| 中医药科技查新报告书 |
（4）EphA4受体对糖氧剥夺/复氧大鼠海马神经元Bdnf表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 原代海马神经元培养及糖氧剥夺/复氧模型制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验设备和试剂 |
| 1.1.1 试剂和耗材 |
| 1.1.2 实验设备 |
| 1.1.3 溶液及药物试剂的配制 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 原代海马神经元培养 |
| 1.3.2 最佳OGD/R模型的选择 |
| 1.3.3 乳酸脱氢酶(LDH)测定 |
| 1.3.4 CCK-8法测定神经元存活率 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同胶质细胞数量对原代海马神经元培养的影响 |
| 2.2 糖氧剥夺不同时间对海马神经元形态的影响 |
| 2.3 不同糖氧剥夺/复氧条件对海马神经元存活率及活力的影响 |
| 3 结论 |
| 第二部分 EphA4受体对糖氧剥夺/复氧海马神经元Bdnf基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验设备和试剂 |
| 1.1.1 试剂 |
| 1.1.2 实验设备 |
| 1.1.3 溶液及药物试剂的配制 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 Western blot |
| 1.3.2 RT-qPCR |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 拮抗EphA4受体功能改变大鼠海马神经元pro-BDNF和BDNF蛋白的表达 |
| 2.2 拮抗EphA4受体功能改变大鼠海马神经元Bdnf基因转录本的表达 |
| 3 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 EphA受体对大鼠海马神经元BDNF表达的影响机制 |
| 1 海马结构 |
| 2 神经营养蛋白家族 |
| 2.1 BDNF差异性表达 |
| 2.2 BDNF对海马神经元的保护性作用 |
| 2.3 组蛋白乙酰化对BDNF表达的影响 |
| 3 Eph蛋白家族 |
| 3.1 EphA受体与组蛋白乙酰化 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）龟鹿二仙胶经成骨细胞来源外泌体抗骨质疏松的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 龟鹿二仙胶在骨质疏松症领域研究进展及其现代应用迷思 |
| 1.1 临床应用 |
| 1.2 基础研究 |
| 1.3 现代应用迷思 |
| 1.4 小结 |
| 2 龟鹿二仙胶治疗原发性骨质疏松症有效性与安全性的Meta分析 |
| 2.1 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 局限性 |
| 2.5 结论 |
| 3 前期研究基础及本课题的研究思路 |
| 3.1 “阴阳平衡”与骨稳态 |
| 3.2 成骨细胞-破骨细胞间信号通路的交互 |
| 3.3 外泌体介导的成骨—破骨细胞间交互作用 |
| 第二部分 成骨细胞来源外泌体的提取、制备与鉴定 |
| 1 材料与设备 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 主要实验方法 |
| 2.1 制备去外泌体血清 |
| 2.2 成骨细胞体外分离培养与鉴定 |
| 2.3 OB-EV制备 |
| 2.4 OB-EV透射电镜观察 |
| 2.5 粒径与浓度检测 |
| 2.6 Western Blot技术检测EV标志蛋白 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 去外泌体血清制备效果验证 |
| 3.2 成骨细胞分离、培养与鉴定 |
| 3.3 EV分离与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 GEG-OB-EV对去势大鼠骨质疏松模型的作用与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制方法 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 体重指数 |
| 2.2 GEG含药血清对OB活性的影响 |
| 2.3 血清骨代谢指标 |
| 2.4 Micro-CT |
| 2.5 骨组织病理学染色 |
| 2.6 PRM检测目标蛋白 |
| 2.7 荧光定量PCR检测TGF-β/Smads通路与破骨分化通路相关指标 |
| 2.8 生物力学测试 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 GEG-Mc3t3-EV对体外培养破骨细胞功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 主要试剂与配制方法 |
| 1.3 细胞系来源 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GEG含药血清对Mc3t3-E1活性的影响 |
| 2.2 EV摄取实验 |
| 2.3 TRAP染色及Image半定量分析破骨细胞分化程度 |
| 2.4 破骨细胞骨吸收能力检测 |
| 2.5 流式细胞术检测RAW264.7凋亡情况 |
| 2.6 RT-PCR检测破骨细胞mRNA表达水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 创新之处 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 三七、三七总皂苷各成分对脑卒中的研究进展 |
| 1 中药三七和其成分的研究 |
| 2 三七总皂苷及其各成分对脑卒中的研究进展 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 LINGO-1及其下游信号通路在缺血性脑卒中后神经再生的机制研究 |
| 1 LINGO-1 |
| 2 EGFR |
| 3 PI3K//AKT |
| 4 PTEN |
| 5 GSK-3β |
| 6 PTE、AKT以及GSK-3β的关系 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 大鼠MCAO模型的建立和评价 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 血塞通对MCAO大鼠术后28天LINGO-1,EGFR以及下游PI3K/AKT通路的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 血塞通对MCAO大鼠术后28天PTEN和GSK-3β的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 血塞通对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 mNSS神经功能评分表 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）应用生理电场调控神经干细胞在体外构建小鼠三维工程化神经组织（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 种子细胞 |
| 1.1.1 胚胎干细胞(ESCs) |
| 1.1.2 诱导性多能干细胞(i PSCs) |
| 1.1.3 雪旺细胞(SCs) |
| 1.1.4 间充质干细胞(MSCs) |
| 1.1.5 神经干细胞(NSCs) |
| 1.2 三维组织中神经干细胞的生长调控 |
| 1.2.1 培养微环境 |
| 1.2.2 支架材料 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 神经干细胞的原代培养 |
| 2.2.2 神经干细胞的体外培养 |
| 2.2.3 三维神经组织的构建 |
| 2.2.4 生理电场的施加 |
| 2.2.5 live/dead测定法 |
| 2.2.6 免疫荧光细胞化学染色实验(IFC) |
| 2.2.7 TUNEL染色 |
| 2.2.8 免疫荧光分析 |
| 2.2.9 电镜 |
| 2.3 图片分析 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 mNSCs传代培养以及生长成细胞球的情况 |
| 3.2 神经干细胞的鉴定 |
| 3.3 培养体系和条件的优化 |
| 3.3.1 不同神经球种植密度下的细胞生长状况 |
| 3.3.2 不同Matrigel胶内生长状况 |
| 3.4 生理电场的刺激对神经干细胞的存活率影响 |
| 3.5 生理电场的刺激促进3D工程化神经组织中神经干细胞的神经分化和神经突起的生长 |
| 3.6 bFGF与生理电场协同作用促进3D工程化神经组织中的神经分化和神经突起生长 |
| 3.7 3D工程化神经组织中神经细胞的形态分析 |
| 3.8 工程化神经组织中神经网络的形成 |
| 3.9 3D工程化神经组织的超微结构 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复 |
| 1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程 |
| 1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法 |
| 1.2 口腔颌面部骨组织工程概述 |
| 1.2.1 骨组织工程中的种子细胞 |
| 1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介 |
| 1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系 |
| 1.3 骨缺损修复材料简介 |
| 1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求 |
| 1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料 |
| 1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石 |
| 1.3.4 用于骨再生的支架材料 |
| 1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用 |
| 1.4 本论文的设计思路和技术路线 |
| 1.4.1 设计思路 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算 |
| 2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备 |
| 2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征 |
| 2.3.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.3.5 形貌与化学组成分析 |
| 2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素 |
| 2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构 |
| 2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响 |
| 2.4.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养 |
| 3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态 |
| 3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖 |
| 3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性 |
| 3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性 |
| 3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性 |
| 3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节 |
| 3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.9 使用三维打印机打印支架 |
| 3.3.10 支架的形貌及成份表征 |
| 3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附 |
| 3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖 |
| 3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性 |
| 3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响 |
| 3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响 |
| 3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响 |
| 3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析 |
| 3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响 |
| 3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响 |
| 3.4.9 三维打印支架的宏观外形 |
| 3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征 |
| 3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附 |
| 3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖 |
| 3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性 |
| 3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组 |
| 4.3.2 术后大体观察 |
| 4.3.3 术后影像学观察 |
| 4.3.4 组织学观察染色 |
| 4.3.5 Masson染色 |
| 4.3.6 体内生物安全性评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立 |
| 4.4.2 动物处死后标本的获取 |
| 4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复 |
| 4.4.4 术后组织学检测 |
| 4.4.5 Masson染色表征 |
| 4.4.6 支架促血管再生 |
| 4.4.7 支架的体内安全性结果分析 |
| 4.4.8 支架促成骨性能讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要创新点 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（10）仿生电磁场在癌症及糖尿病治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 癌症治疗现状 |
| 1.1.2 糖尿病治疗现状 |
| 1.2 生物电磁学研究现状 |
| 1.2.1 生物电磁效应 |
| 1.2.2 生物电磁效应机制 |
| 1.2.3 电磁治疗 |
| 1.3 本文研究内容及意义 |
| 1.3.1 本文研究内容 |
| 1.3.2 本文研究意义 |
| 第2章 BIEMF及生物电磁效应方向性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 自然电磁场及仿生电磁场 |
| 2.2.1 地球磁场 |
| 2.2.2 舒曼共振 |
| 2.2.3 细胞脉动 |
| 2.2.4 脑电波 |
| 2.2.5 仿生电磁场(BIEMF) |
| 2.3 BIEMF发射仪器的选择与电磁场的表征 |
| 2.3.1 BIEMF发射仪器介绍 |
| 2.3.2 磁场检测系统的介绍 |
| 2.3.3 二氧化碳培养箱内磁场强度及方向测量结果 |
| 2.4 不同方向BIEMF对细胞ATP合成的影响 |
| 2.4.1 主要试剂及仪器 |
| 2.4.2 细胞培养 |
| 2.4.3 ATP检测实验 |
| 2.4.4 统计学分析 |
| 2.4.5 ATP检测实验结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 BIEMF对Hela细胞增殖抑制作用的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 BIEMF对体外培养Hela细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 主要试剂及仪器 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 结晶紫染色实验 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.2.5 BIEMF对不同浓度Hela细胞增殖抑制作用 |
| 3.2.6 BIEMF对 Hela细胞增殖抑制作用密度依赖性验证试验 |
| 3.3 BIEMF抑制Hela细胞增殖机理初步探究 |
| 3.3.1 主要试剂及仪器 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 DAPI染色实验 |
| 3.3.5 细胞有丝分裂染色实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 BIEMF糖尿病治疗作用的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 BIEMF对体外培养HepG2细胞葡萄糖消耗的影响 |
| 4.2.1 主要试剂及仪器 |
| 4.2.2 细胞培养 |
| 4.2.3 葡萄糖消耗检测实验 |
| 4.2.4 统计学分析 |
| 4.2.5 葡萄糖消耗检测结果 |
| 4.3 BIEMF对Beta-TC-6细胞胰岛素分泌的影响 |
| 4.3.1 主要试剂及仪器 |
| 4.3.2 细胞培养 |
| 4.3.3 葡萄糖刺激胰岛素分泌实验 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.3.5 胰岛素检测实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 可穿戴BIEMF治疗仪发射端的设计与制作 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 BIEMF发射端的设计 |
| 5.2.1 单个BIEMF发射端的设计 |
| 5.2.2 BIEMF发射端组合方式的设计 |
| 5.3 BIEMF发射端的仿真 |
| 5.3.1 ANSYS Maxwell软件简介 |
| 5.3.2 有限元仿真的实现 |
| 5.3.3 仿真结果分析 |
| 5.4 BIEMF发射端的制作与检测 |
| 5.4.1 主要材料及仪器 |
| 5.4.2 BIEMF发射端的制作 |
| 5.4.3 BIEMF发射系统的搭建 |
| 5.4.4 BIEMF发射端的磁场检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 BIEMF人体组织穿透能力的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 电磁场在生物组织中衰减的理论分析 |
| 6.2.1 生物组织的电磁特性 |
| 6.2.2 电磁场在各组织中的衰减量计算 |
| 6.3 人体腹部及肝脏三维建模 |
| 6.3.1 PTC Creo软件简介 |
| 6.3.2 人体腹部及肝脏解剖学结构分析 |
| 6.3.3 人体腹部及肝脏三维模型创建 |
| 6.4 有限元仿真的实现 |
| 6.4.1 三维模型导入及线圈排布 |
| 6.4.2 设置各组织电磁特性参数 |
| 6.4.3 网格划分及求解设置 |
| 6.4.4 仿真结果分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 本文创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响（论文参考文献）
- [1]氯化锰对小鼠精原干细胞的损伤及机制研究[D]. 姜璘. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]原代大鼠海马神经元中Sema3F对CREBBP基因及转录水平影响的相关性研究[D]. 王婷. 内蒙古医科大学, 2021
- [3]基于定量化学蛋白质组学研究雷公藤红素抗缺血性脑卒中的靶点[D]. 刘丹丹. 中国中医科学院, 2021
- [4]EphA4受体对糖氧剥夺/复氧大鼠海马神经元Bdnf表达影响的研究[D]. 史晋朝. 山西医科大学, 2021
- [5]OTUD3对神经干细胞增殖和分化影响的研究[D]. 赵琦琦. 青岛大学, 2021
- [6]龟鹿二仙胶经成骨细胞来源外泌体抗骨质疏松的作用与机制研究[D]. 司誉豪. 南京中医药大学, 2021(01)
- [7]血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究[D]. 周东蕊. 北京中医药大学, 2021(01)
- [8]应用生理电场调控神经干细胞在体外构建小鼠三维工程化神经组织[D]. 杜颖珊. 吉林大学, 2021(01)
- [9]含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究[D]. 刘鹏. 吉林大学, 2021(01)
- [10]仿生电磁场在癌症及糖尿病治疗中的应用研究[D]. 刘学磊. 吉林大学, 2021(01)