一、内皮祖细胞与血管新生(论文文献综述)
夏琰[1](2021)在《人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景随着现代交通及工业的迅速发展,高能量损伤越来越多。在高能量创伤患者中,严重四肢创伤的比例大量增加,且往往合并大段骨缺损,其治疗一直是临床医生面临的巨大挑战。骨组织工程学的出现和迅速发展,为大段骨缺损的修复开辟了新途径。然而目前临床所使用的各类骨移植材料,对于大段骨缺损修复的临床疗效并不令人满意,关键原因在于移植材料的促血管化能力较弱。在体外及动物实验中,人们已经发现利用干细胞联合骨移植材料可以有效提高骨移植材料的成血管能力,但这类治疗方式仍存在着干细胞来源有限、诱导增殖效率低、免疫排斥反应、潜在致瘤性、伦理争议等问题,临床应用受到极大限制。近年来,随着对干细胞促进组织修复研究的不断深入,人们发现干细胞所产生的外泌体可能在其中扮演了重要的角色,并有望为大段骨缺损的治疗带来新的希望。研究目的本次课题研究拟从人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,uMSCs)中分离、提取外泌体(uMSCs-Exosomes,uMSCEXOs),并对其进行鉴定。同时利用微流控技术构建出透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶(Hydrogel,Gel)缓释系统,并将外泌体包裹于其中,以期实现对外泌体的有效负载与长效释放。通过动物体内骨折及临界性骨缺损模型,验证uMSCEXOs通过加速血管新生从而促进骨修复的作用;再通过体外细胞实验,进一步验证uMSCEXOs对血管内皮祖细胞成血管分化的影响;最后,通过分子生物学、生物信息学等手段,筛选出uMSCEXOs中的关键性物质,并探索其促进血管新生的内在分子机制,为今后外泌体在大段骨缺损治疗中的应用提供了新的理论依据和研究方向。研究方法1.外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备(1)利用超速离心法,从uMSCs和人胚胎肾细胞293(HEK293)中分离、提取外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和Western blotting技术对其进行观察及鉴定。(2)利用微流控技术,以HA为原料,合成制备出HA-Gel,并将上述所提取的外泌体包裹于其中,形成外泌体/水凝胶复合体(uMSCEXOs/Gel或HEK293EXOs/Gel)通过模拟体液浸泡及纳米颗粒跟踪分析技术,检测HA-Gel对外泌体的的负载和缓释性能。2.uMSCEXOs促进骨修复的动物体内实验(1)构建大鼠股骨干横断骨折的动物模型,按照分组(uMSCEXOs/Gel组、HEK293EXOs/Gel组、Gel组),将不同成分的的物质注射至骨折端,术后通过X线、Micro-CT及组织学检查,评价各组的骨折修复情况及骨痂内的血管新生情况;(2)构建大鼠颅骨临界性骨缺损模型,并利用3D打印技术制备了纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合支架(nano HA/PCL scaffolds,n HP)。而后根据分组(uMSCEXOs/Gel/n HP组、HEK293EXOs/Gel/n HP组、Gel/n HP组、空白组),将不同成分的的外泌体/水凝胶复合体联合多孔人工骨支架并固化后植入骨缺损区域,术后通过Micro-CT及组织学检查,分析评价各组骨缺损的修复情况及植入区域内的组织成份变化情况;(3)通过上述两部分动物实验,明确uMSCEXOs在本次研究中对骨修复的作用。3.uMSCEXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验实验分组:uMSCEXOs组、HEK293EXOs组、Gel组、空白组选择内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)作为本次课题研究中体外细胞实验部分的研究对象。通过将uMSCEXOs与EPCs共培养来观察外泌体进入细胞的情况;通过CCK-8实验,检测各组细胞增殖的情况;通过Transwell实验、划痕实验来检测各组细胞迁移的情况;通过成管实验,检测各组中细胞血管形成的情况;最后通过RT-PCR技术,检测经干预后,各组EPCs内成血管相关基因的表达变化情况;最终明确uMSCEXOs对EPCs成血管分化的作用。4.uMSCEXOs促进血管新生的机制探索首先采用高通量测序技术,分别对uMSCEXOs和HEK293EXOs中的mi RNAs含量进行测定,并于网上已公布的uMSC的mi RNA含量进行对比,筛选出含量最高的mi RNA,并作为下一步的研究目标;接着构建出不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs,通过透射电镜和Western blotting的方法对其进行鉴定;再将其作用于EPCs,通过体外成管实验,观察对EPCs血管形成能力的影响;通过鸡胚绒毛尿囊膜实验评价经不同mi RNA-21水平的uMSCEXOs干预后对体内血管生成的影响;最后通过RT-PCR、Western blotting技术检测EPCs内相关基因及蛋白的表达变化,推测潜在的分子机制。研究结果1.外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备本部分实验中,使用超速离心技术,从uMSCs及HEK293细胞中分离并提取了外泌体,透射电镜及纳米颗粒跟踪分析显示uMSCEXOs粒径大小约为60-130mm;另外,纳米颗粒跟踪分析结果还显示本研究所分离、提取的uMSCEXOs的浓度为4.2×105个/ml;Western blotting的结果显示,分离出的外泌体其表面特异蛋白CD81、CD63和CD9均显示为阳性。以上实验结果表明我们成功的对外泌体进行了分离和提取。核磁共振氢谱结果显示甲基丙烯酸酐修饰HA成功。所构建的HA-Gel缓释系统被注射在不同形状的模具中后,经紫外线照射,可被固化、塑形为多种形状。接下来的模拟体液浸泡实验,结果显示,将HA-Gel置于模拟体液中浸泡后,其所负载的外泌体会随着水凝胶的降解缓慢释放出来,当浸泡达到20天时,仍有约40%的uMSCEXOs存留于HA-Gel内。2.uMSCEXOs促进骨修复的动物体内实验我们首先成功建立了大鼠股骨干横断骨折模型,按照实验分组,分别在大鼠骨折端处注射含不同成分的物质,术后所有动物切口愈合良好;术后2-4周的X线显示,uMSCEXOs/Gel组的骨痂宽度明显大于对照组;术后2周对骨折端的Micro-CT扫描显示,uMSCEXOs/Gel组骨折端骨痂的骨密度、新生骨体积均高于对照组,同时血管成像也显示uMSCEXOs/Gel组新生血管数量和体积都明显高于对照组;组织学结果显示,uMSCEXO/Gel组中成血管相关蛋白CD31的表达,同样明显高于对照组。接下来,我们又成功建立了大鼠颅骨双侧临界性骨缺损模型,并利用3D打印技术成功制备了纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合支架(nano HA/PCL scaffolds,n HP)。按照实验分组,将不同的复合材料植入骨缺损区域内。术后所有动物切口愈合良好;术后4、8周的Micro-CT结果显示,uMSCEXOs/Gel组的骨修复明显优于其余对照组,定量分析同样显示,uMSCEXOs/Gel组的骨密度、新生骨体积、骨小梁密度及厚度值,均明显高于对照各组;术后8周的组织学结果显示,uMSCEXOs/Gel组中可见大量类骨基质及胶原组织长入了材料内部,而对照组则较少新生组织长入,免疫组化的结果进一步显示,在uMSCEXOs/Gel组中,材料内部组织中的成骨及成血管相关蛋白的表达明显强于对照各组。上述体内实验结果表明,在添加了uMSCEXOs后,骨折及骨缺损的修复效果明显得到了增强。3.uMSCEXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验本部分实验中,首先将uMSCEXOs与EPCs染色并共培养24小时后,荧光显微镜下可见uMSCEXOs成功进入EPCs内。而后根据实验分组,分别将不同物质EXOs/Gel与EPCs共培养,细胞增殖实验结果显示,相较于对照各组,uMSCEXOs明显促进了EPCs的增殖;Transwell实验和划痕实验的结果显示,uMSCEXOs明显提高了EPCs的迁移能力;成管实验的结果显示,uMSCEXOs/Gel明显提高了EPCs的成管能力;RT-PCR实验结果显示,经uMSCEXOs干预后,EPCs的成血管相关基因(VEGFA、CD31、HIF-1α)的表达相较于对照各组均明显提高,而各对照组之间却未见明显差异。上述体外细胞实验结果表明,在添加了uMSCEXOs后,EPCs的增殖、迁移及成血管化能力得到了显着增强。4.uMSCEXOs促进血管新生的机制探索在本部分实验中,高通量测序的结果显示,uMSCEXOs、HEK293EXOs及uMSCs所包含的mi RNAs特异性显着,仅有mi RNA-21的在uMSCEXOs及uMSCs中都是表达最高的。结合文献报道,我们推测,mi RNA-21很可能是uMSCEXOs产生明显促成血管作用的关键性物质。我们构建了不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs并对其进行了鉴定。接下来,我们通过体外成管实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验、RT-PCR及Western blotting检测,验证了不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs对EPCs的作用。实验结果显示,当uMSCEXOs中mi RNA-21表达受到抑制时,EPCs的成管能力(成管实验中的新生血管长度及数量、鸡胚绒毛尿囊膜内的新生血管长度及数量)及相关成血管基因、蛋白(VEGFA、HIF-1α)的表达都明显降低,而NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路中NOTCH1及DLL4的表达却明显升高。上述实验结果表明,mi RNA-21在uMSCEXOs促EPCs成血管分化的过程中扮演了关键角色,且可能是通过抑制NOTCH1/DLL4/信号通路并促进VEGFA和HIF-1α的表达发挥作用。研究结论1.通过超速离心技术分离并提取了uMSCs中的外泌体,并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotting技术对其进行了鉴定,验证了uMSCEXOs的正确性,表明超速离心技术是一种安全、可靠、高效的外泌体提取方法;2.通过微流控技术所制备的HA-Gel缓释系统,在模拟体液中浸泡20天后,仍有约40%的外泌体存留于该水凝胶缓释系统内。表明该HA-Gel缓释系统可以实现对外泌体的有效负载与长效释放;3.我们成功建立了大鼠股骨干骨折模型及大鼠颅骨临界性骨缺损模型,并将不同成分的外泌体/水凝胶复合物注射或联合支架移植于骨修复处,术后通过影像学及组织学手段,对比各组的骨修复效果、血管新生情况及手术区域组织内的成分变化,结果显示,在2组动物模型中,含有uMSCEXO组的骨修复效果及血管新生情况均明显优于其余各组,同时含有uMSCEXO的组手术区域内的成血管相关蛋白的表达亦明显高于其余各组。表明uMSCEXO在动物体内,有效的促进了骨折及临界性骨缺损的修复并增强了血管新生的效果。4.通过体外细胞实验(细胞增殖、细胞迁移、小管形成等),验证了uMSCEXOs能有效地促进内皮祖细胞的增殖、迁移与成血管分化。5.通过高通量测序技术,我们筛选确认mi RNA-21是uMSCEXOs中含量最高的微小非编码核糖核酸。同时,进一步验证了mi RNA-21在uMSCEXOs促进内皮祖细胞有效成血管分化中所起的重要作用,且推测可能是通过调节NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路发挥了作用。
王禹萌[2](2020)在《黄芪甲苷促人内皮祖细胞分泌血管生长因子的实验研究》文中研究说明目的:探讨黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)对人内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)分泌血管生长因子的影响,为深入研究AS-Ⅳ调节EPC s介导的血管新生的作用机制奠定基础。方法:取足月健康新生儿脐带血10ml,用密度梯度离心法进行离心分层后获取单个核细胞层,用培养基进行传代培养,当细胞呈现梭形时对细胞进行CD31抗体和DAPI核染鉴定,双阳性者则鉴定为EPCs。将获得的EPCs随机分组,实验组用浓度为100mg/L的AS-Ⅳ溶液干预,对照组用等量的PBS液处理,培养24h后,通过酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测标准孔、空白孔中的血管内皮生长因子a(Vascular endothelial growth factor,VEGFa)、VEGFb、VEGFc、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血管生成素-1(Angiopoietin-1,Ang-1)的OD值,以此绘制标准曲线,最终测得待测样品孔中的OD值,根据标准曲线获得各个血管生长因子浓度。结果:1.培养第7天,经CD31抗体和DAPI核染双阳性鉴定证实成功获取EPCs,所获得的EPCs在光镜下排列紧密,细胞边缘清晰,呈典型集落形态、铺路石样排列,中央细胞呈圆形,周边细胞呈梭形。2.进一步实验发现,实验组人EPC s分泌的血管生长因子VEGF a、VEGF b、VEGF c、FGF、Ang-1的浓度与对照组相比,均明显增高,P﹤0.01,差异有显着统计学意义(分别为t=9.84、t=45.24、t=14.51、t=6.27、t=6.57)。结论:1.用密度梯度离心法可通过新生儿脐带血获得纯度较高的人内皮祖细胞,所获得的内皮祖细胞呈梭形、呈典型集落形态、铺路石样排列。2.100mg/l的AS-Ⅳ可促进内皮祖细胞通过旁分泌作用释放血管生长因子VEGF a、VEGF b、VEGF c、FGF和Ang-1,具有调节EPCs介导血管新生的巨大潜能。
方杰[3](2020)在《自体骨髓源性内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的临床研究》文中进行了进一步梳理研究背景:以脑梗塞为代表的缺血性脑卒中是中枢神经系统(central nerve system,CNS)的常见病和多发病,多数存活者会遗留运动、感觉、认知等功能障碍。早期溶栓公认有效,但由于限于严格的时间窗及出血等风险,使之应用受限;且至今为止,对遗留的CNS功能障碍并无确切疗效的治疗方法,尤其是慢性期脑梗塞所致的CNS功能障碍,严重危害脑卒中患者的生存质量,给患者个人、家庭和社会都带来了沉重的经济负担和心理负担,亟需探寻新的、安全有效的治疗策略。随着干细胞研究的不断深入,我们发现骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)具有分化为成熟内皮血管的功能,以及参与到血管新生、促进血脑屏障(brain blood barrier,BBB)及神经功能修复的潜力,是极具治疗应用前景的干细胞疗法种子细胞。本课题在团队前期干细胞有效性、安全性实验研究均获得一定成果基础上,以严格遵循临床试验研究规范为前提,对急、慢性缺血性脑卒中临床志愿者干细胞移植治疗进行疗效与安全性评估,旨在为干细胞临床神经医学转化提供有意义数据支持及可借鉴规范流程、可行的评估指标依据。研究内容:1.探讨自体骨髓源性EPCs在治疗急性期脑梗塞中的安全性和初步疗效。2.探讨自体骨髓源性EPCs在治疗慢性期脑梗塞中的安全性和初步疗效。研究方法:第一部分1.选取符合纳入标准的急性期缺血性脑卒中(发病<7天)患者18例,采用分层区段随机化法随机分入EPCs组、BMSCs组(阳性对照)和安慰剂组,每组各6例,入组患者均接受缺血性脑卒中后的二级预防等基础治疗;2.基线评估:患者入组后进行常规的实验室生化检查、心电图、心脏彩超和头颅磁共振。功能评估包括mRS、NIHSS、Barthel Index和SSS量表;3.EPCs组和BMSCs组患者在病程第7天提取骨髓,进行体外培养和扩增后经外周静脉回输体内(2.5×106/kg体重/次,隔2周一次、共两次),安慰剂组只回输相同体积的生理盐水;4.在移植后第3、6、12和48个月对基线指标进行随访,并记录与试验可能相关的不良事件。第二部分1.选取符合纳入标准的慢性期缺血性脑卒中(发病>6个月)患者14例,分为EPCs组和对照组,每组各7例,入组患者均接受缺血性脑卒中后的二级预防等基础治疗;2.基线评估:患者入组后进行常规的实验室生化检查、心电图、心脏彩超和头颅磁共振。功能评估包括 mRS、NIHSS、Barthel Index、SSS、Fugl-Meyer量表3.EPCs组患者进行基线评估后提取骨髓,进行体外培养和扩增后经外周静脉回输体内(2.5×106/kg体重/次,隔2周一次、共两次);4.在移植后次日及移植后第3、6、12和24个月对基线指标进行随访,并记录与试验可能相关的不良事件。研究结果:1.EPCs移植治疗急性期缺血性脑卒中的不良事件(0例)明显少于BMSCs组(1例)和安慰剂组(4例),差异有统计学意义(P<0.05),但48个月死亡率无明显差异(P>0.05);随访第3个月时,EPCs组的SSS评分(47.20±2.96)明显高于BMSCs组(29.00±2.04)和安慰剂组(36.80±4.19),差异有统计学意义(P<0.05),其余时间点功能评分无显着差异(P>0.05)。2.EPCs移植治疗慢性期缺血性脑卒中发生的不良事件发生率(1例)与安慰剂组(4例)差异无统计学意义(P>0.05),两组在到达24个月随访期时均无死亡;EPCs组在随访3月时的Barthel Index评分(92.5±6.12)、NIHSS评分(5.00±2.68)优于安慰剂组(分别为70.00±15.17、7.17±0.98),差异有统计学意义(P<0.05),但安慰剂组Fugl-Meyer评分(171±28.01)优于EPCs组(168.83±13.00),差异有统计学意义(P<0.05)。12和24个月时EPCs组Fugl-Meyer评分(分别为179±15.86和178.33±16.22)均优于安慰剂组(分别为169.83±32.39和167.83±32.55),差异有统计学意义(P<0.05)。其余时间点功能评分无显着差异(P>0.05)。研究结论:1.在未增加死亡率的前提下,自体骨髓源性EPCs移植治疗急性期缺血性脑卒中具有较高的安全性,并且在3个月时表现出更佳的功能恢复。2.在未增加死亡率和不良反应发生率的前提下,自体骨髓源性EPCs移植治疗慢性期缺血性脑卒中表现出更佳的功能恢复效果,并持续到24个月。
胡峻贤[4](2020)在《WKYMVm与YIGSR双肽协同作用对骨缺损修复影响及其机制的初步探讨》文中指出背景:骨缺损(Bone defects)是骨科最常见的病之一,其在临床上有较高的发病率,并且具有治愈率低,并发症多等特点。在骨缺损的修复治疗当中炎症、细胞募集、血管生成与骨生成是修复成功与否的四个关键步骤,如何有效且精确的调控四个步骤成为骨修复相关研究中的关键。在上述四个关键过程当中,充足的血管生成是骨修复的前提条件,足够的血流不但能够保证在骨修复过程中充足的氧气与营养,带走代谢废物,也能为缺损部位营造理想的微环境。相反,大量研究表明缓慢且不充足的血管再生会阻碍骨修复。因此,解决骨修复问题关键是要解决缺损部位血管化问题。而近几年研究发现内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在促进骨修复的血管化问题中发挥重要作用。这是一种来源于骨髓和血管中的细胞,在骨缺损发生以后能够被募集到损伤部位进行血管修复工作。这种祖细胞又可以分为早期内皮祖细胞与晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞通过分泌各种血管生成相关因子,例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor)等等。晚期内皮祖细胞对血管生成有着更加重要的作用,相比早期内皮祖细胞,晚期内皮祖细胞具有高增殖性,能够分化为内皮细胞来形成新生血管。尽管EPCs细胞在血管再生中占据着重要的位置,但是在利用其用于治疗时往往受限于它细胞数量少、迁移能力差等因素。考虑到血管再生在组织工程骨与骨修复中占据着重要部位,越来越多研究致力于增强EPCs的内源性募集来促进血管再生。除了血管修复以外,治疗效果最终取决于是否能够生成足够且成熟致密的骨组织,在骨生成的过程当中,成骨相关细胞的成骨过程与破骨细胞的骨吸收过程保持着精妙的平衡。干/祖细胞能够被募集到骨缺损部位成骨或者成软骨,并且参与骨组织的形成。通常来说骨的形成过程一般分为两类:膜内成骨,软骨内成骨。在膜内成骨的过程中,未分化的骨前体细胞与MSC细胞增殖随后直接分化成为骨细胞,这个过程能够导致坚硬的骨痂形成。相反,在软骨内成骨当中,骨组织形成之前MSC细胞分化为软骨细胞并分泌软骨基质。不管在哪种过程当中,破骨细胞也同样会被募集到缺损部位,吸收多余或者坏死的骨质,为成骨营造良好的微环境。但是由于缺损骨周围常常处于炎症环境,这会造成破骨细胞的过渡活跃,最终导致过量的骨吸收,使得新生骨密度不够,或者修复失败。如何调节骨生成与骨吸收之间的微妙平衡也非常重要。成骨相关细胞因其分化周期长,种类多,机制复杂等原因,成为难以调控的环节;而破骨细胞是骨细胞中唯一具有骨吸收功能的细胞,并且其分化周期短,使得其成为这个过程中相对比较好调控的细胞,有效、精确的调控破骨细胞成熟分化也能够维持骨生成-吸收之间的精妙平衡。仿生多肽是一类根据序列不同而被设计出来的一类多肽,这一类多肽往往是细胞某个膜蛋白的特殊激动剂,或者具有特定功能,例如增加细胞粘附性,促进细胞分化等等。目前,仿生多肽因其免疫反应低,价格便宜,生物功能效率高等优势在各个领域的疾病治疗中都被涉及,并且越来越多的骨材料方面的研究都以仿生多肽作为重点关注对象。WKYMVm是一种仿生多肽,它具有促进细胞增殖、分化的重要作用。之前有研究证明WKYVMm可以通过募集EPCs到缺血部位,以此来治疗动物肢体的缺血模型。但是其在骨缺损中是否能够促进血管新生与调节骨再生平衡还是未知,因此我们预测:在骨缺损中WKYMVm能够内源性募集EPCs进行血管修复。并且WKYMVm是FPR2受体的强烈激动剂,实验证明其他FPR2激动剂能够有效抑制破骨细胞分化,所以我们进一步推测:WKYMVm具有抑制破骨细胞分化作用,从而更进一步营造有利于骨修复的环境。YIGSR是一种促进细胞粘附的仿生多肽,经常应用于骨组织工程当中增加骨材料对组织细胞的粘附性。在以往的研究中,YIGSR除了能够增加对细胞的粘附性,还具有与其他生物多肽联用达到更好效果的特点,例如其与RGD联用,与单独使用RGD比较起来,两种多肽联用更能促进微血管内皮细胞的募集与归巢。因此,我们提出假说:YIGSR与WKYMVm两种多肽联用能够更好地促进EPCs的内源性募集与血管再生能力,有效的对缺损部位的血管进行再生,从而达到促进缺损部位的骨修复目的。本研究首先体外研究了WKYMVm与YIGSR单独使用对EPCs血管生成作用与迁移作用的影响,其次研究了两种多肽联用对EPCs血管生成与迁移作用的影响以及相关机制,并且证明了WKYMVm能够抑制破骨细胞的分化成熟,最后在骨缺损动物模型中进行研究来探讨其体内发挥的作用。主要研究内容及方法:1.体外分离、培养、鉴定原代EPCs细胞。2.体外使用CCK-8检测WKYMVm与YIGSR对EPCs细胞的增殖影响。3.体外利用Transwell与划痕实验,检测WKYMVm与YIGSR分别使用与联用对EPCs细胞迁移的影响。4.体外采用基质胶血管生成实验,检测WKYMVm与YIGSR分别使用与联用对EPCs体外管腔形成影响。5.利用Western blot与qRT-PCR检测了WKYMVm与YIGSR分别使用与联用对EPCs表达分泌VEGF-A与CXCR4的影响,以及是否通过FPR2/PI3K/AKT/VEGF-A通路来发挥作用。6.体外利用Trap染色,Western blot,PCR,骨吸收实验等,研究WKYMVm对破骨细胞分化以及骨吸收功能的影响。7.建立大鼠股骨缺损模型以验证WKYMVm与YIGSR在体内的促血管再生和促骨愈合作用。结果:1.成功分离,纯化,扩增并鉴定大鼠EPCs细胞。2.CCK-8实验证明了WKYMVm与YIGSR的浓度处于0,0.01,0.1,1,10μM时,对EPCs细胞增殖无影响。3.体外管腔形成实验显示WKYMVm在0.01,0.1,1μM时,对EPCs管腔形成具有浓度依赖性的正向影响,但是在浓度1μM以上效果不随浓度增加而增加,YIGSR在0.1μM以下对EPCs作用不明显,0.1μM以上对EPCs管腔形成呈现出抑制作用,两种多肽在联用以后比单独使用促进EPCs管腔形成的效果明显,并且以W肽在1μM,Y肽在0.1μM时联用效果最佳。4.Transwell与划痕实验显示,WKYMVm与YIGSR联用后使得EPCs迁移能力增加,且效果优于单个多肽使用。5.WKYMVm与YIGSR能够使得EPCs中血管生成相关因子表达显着增高。6.WKYMVm与YIGSR联用通过FPR2/PI3K/AKT/VEGF-A通路促血管形生成。7.WKYMVm具有抑制破骨细胞分化并且抑制破骨吸收功能的作用。8.动物实验中,WKYMVm与YIGSR联用能够内源性募集EPCs并最终促进骨修复上具有重要作用。结论:1.WKYMVm与YIGSR联用能够通过FPR2/PI3K/AKT/VEGF-A通路显着的促进EPCs细胞的血管形成。2.WKYMVm体外能够有效抑制破骨细胞生成以及破骨细胞吸收功能。3.体内联用WKYMVm与YIGS能够内源性募集EPCs并可促进大鼠股骨缺损的修复。
焦健[5](2019)在《MiR-205调控内皮祖细胞血管新生和溶栓作用的研究》文中研究表明目的:明确 miR-205 对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、凋亡、迁移和成血管能力等生物学功能的影响;明确miR-205对EPCs向深静脉血栓部位归巢能力的影响及其治疗效果;探讨miR-205调控EPCs血管新生的靶点及调控机制。方法:1.利用慢病毒感染EPCs,分为四组:即空白对照组(未经处理的EPCs),NC组(慢病毒空载LV3-NC质粒递送入EPCs),miR-205 mimics组(miR-205过表达组)和miR-205 inhibitor组(miR-205表达下调组),利用荧光显微镜和RT-qPCR检测感染效率。2.分别采用划痕实验、transwell实验及成血管实验检测EPCs的迁移、侵袭和成血管能力;CCK8检测EPCs增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞凋亡情况;EPCs与基质胶栓混合后注射入裸鼠皮下模拟体内血管新生检测体内血管新生情况,HE染色观察新生血管的形成情况。3.建立裸鼠颈静脉血栓模型,并移植带有绿色荧光蛋白的过表达miR-205的EPCs(GFP-miR-205 EPCs),1周后,取出血栓段颈静脉组织,测量其大小和重量,明确其治疗效果;绿色荧光检测EPCs归巢至深静脉血栓部位的情况。4.双荧光素酶实验、RT-qPCR、Western blotting及共转染检测细胞功能实验探讨miR-205调节EPCs的靶点PTEN及调控机制。结果:1.慢病毒感染后的EPCs生长状态良好,荧光和RT-qPCR结果显示慢病毒感染成功。2.过表达miR-205明显增强EPCs的迁移、侵袭、成血管和增殖能力并抑制凋亡,在体内明显增强血管新生能力;相反,下调miR-205明显抑制EPCs的迁移、侵袭、成血管和增殖能力并促进凋亡,在体内明显减弱血管新生能力。3.miR-205 4.PTEN 是 miR-205 调控 EPCs 的靶点。结论:MiR-205以PTEN为靶点增强EPCs的增殖、归巢和体内外血管新生能力,并抑制细胞凋亡,促进深静脉血栓的溶解和再通。
李勇[6](2019)在《血管生长因子AGGF1通过增强内皮祖细胞功能治疗糖尿病小鼠后肢缺血》文中进行了进一步梳理AGGF1(Angiogenic factor with G-patch and FHA domain1)基因突变导致人先天性骨肥大性静脉曲张综合征(Klippel–Trénaunay syndrome,KTS)。AGGF1基因定位于第五号染色体5q13,并编码一个新的血管生长因子。AGGF1蛋白质包含有4个已知的结构域,分别是N端的coiled coil区,OCRE区,C端的FHA(Forkhead-associated domain)区和G-patch区,共714个氨基酸。AGGF1在鸡胚绒毛尿囊膜实验(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)中表现出与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)功能相当的促血管新生能力。在小鼠后肢缺血模型的基因治疗中,肌肉注射的AGGF1质粒能有效表达并促进缺血肢的血流恢复和血管新生。在斑马鱼研究中发现,AGGF1是静脉和血液血管母细胞(分化为内皮细胞和血细胞)分化所必需的。在冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD)和心肌梗死(myocardial infarction,MI)治疗中,基于AGGF1蛋白的抗血管渗漏功能,其治疗效果优于传统VEGFA治疗。此外,近期研究发现AGGF1蛋白治疗可以有效抑制血管损伤后新生内膜形成,这对动脉粥样硬化,冠心病和心肌梗死等心血管疾病的血管重建术后血管再狭窄进行治疗具有重要意义。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以长时间高血糖为特征的常见的代谢紊乱疾病,并伴有多种并发症,主要包括外周血管疾病(perpherial vascular disease,PAD)、心血管疾病、脑血管疾病、慢性肾病、糖尿病酮酸症(diabetic ketoacidosis,DKA)、高渗性非酮症糖尿病昏迷(hyperosmolar hyperglycemic state,HSS)以及眼疾等。糖尿病影响全球超过4个亿的人群,其与血管内皮功能失常密切相关。在糖尿病病人中,血管并发症往往与血管生长,重构,氧化应激,内皮细胞再生以及血管新生息息相关。因此,在临床上急需发展治疗干预方法以修复糖尿病患者体内功能失常内皮细胞以及恢复其血管血流。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞的前体细胞,它具有增殖分化能力,在体内能生成血管,在体外能形成官腔样结构。内皮祖细胞在糖尿病条件下功能失常并导致缺血后修复性血管新生减少。近年来,大量研究表明,内皮祖细胞在血管损伤修复和血流再灌注方面具有一定效果,但其效果有待进一步提高。因此,我们设想AGGF1蛋白可能通过增强内皮祖细胞功能以治疗糖尿病条件下的血管疾病。同时AGGF1蛋白可能与糖尿病条件下内皮祖细胞功能失常有关。该论文项目设计了一系列分子水平,细胞水平及动物个体水平的实验对这些假设进行了验证并尝试阐明AGGF1调控内皮祖细胞功能以及治疗糖尿病条件下血管疾病的分子机制。本论文以AGGF1为研究对象,探讨其在内皮祖细胞中的功能以及AGGF1蛋白在内皮祖细胞治疗糖尿病后肢缺血中的作用。我们研究发现,在高脂肪食物诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠EPCs中,EPCs的血管形成能力、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力均较对照组减弱。类似的,相比于野生型(WT)小鼠,来源于Aggf1基因杂合敲除鼠(Aggf1+/-)的EPCs也呈现出较弱的血管形成能力、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力。此外,在db/db小鼠EPCs中,EPCs的血管形成能力、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力均较对照组减弱,并且Aggf1+/-db/db小鼠EPCs的血管形成能力,增殖,跨内皮细胞迁移以及迁移能力最弱。当用高浓度葡萄糖处理(High glucose,HG)野生型EPCs(模拟糖尿病条件)时,EPCs血管形成、增殖、跨内皮细胞迁移以及迁移能力降低,但是这种高糖处理给EPCs所带来的负面效应能有效的被AGGF1蛋白预处理所拮抗。EPCs在高糖处理后活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平上升,AGGF1蛋白能抑制HG所导致的ROS上升。更重要的是,在治疗上,AGGF1蛋白预处理的EPCs能够显着地增强高脂肪食物诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠和db/db小鼠缺血后肢的血流恢复和血管新生。这些结果表明AGGF1蛋白有望发展成为基于EPCs的治疗糖尿病的潜在靶点。分子机制研究显示,高糖处理后Fyn的细胞核内聚集增加,Nrf2的细胞核内聚集减少,从而导致Nrf2的下游靶基因如HO-1、NQO-1、CAT表达受到抑制,最终导致细胞的抗氧化能力下调,但是AGGF1的存在可以下调Fyn的细胞核内聚集,增加Nrf2的细胞核内聚集,从而引起Nrf2的下游靶基因如HO-1、NQO-1、CAT表达上升,最终使EPCs呈现出强的抗氧化应激能力。这表明HG氧化应激所导致的负面效应可以被AGGF1蛋白有效的拮抗。此外,当我们使用PI3K抑制剂Wartmannin时,AGGF1蛋白对HG所诱导的氧化应激的拮抗保护效应消失,当我们使用Akt或者Nrf2的小分子干扰RNA敲低Akt或者Nrf2表达时,AGGF1蛋白对EPCs功能的保护效应消失。以上研究结果表明:(1)AGGF1蛋白是EPCs血管新生功能必需的;(2)AGGF1蛋白可以增强EPCs对糖尿病条件下氧化应激的抵抗能力;(3)AGGF1蛋白可以显着增加EPCs在治疗糖尿病后肢缺血小鼠中的血流恢复能力和血管新生能力;(4)AGGF1通过调控p Akt/Fyn/Nrf2信号通路拮抗糖尿病条件下EPCs功能失常;(5)首次提出AGGF1蛋白治疗可能是一种新的有效的糖尿病血管相关疾病治疗手段。
刘洁,罗展雄[7](2019)在《白藜芦醇对缺血性心脏病患者血管内皮祖细胞的影响机制》文中进行了进一步梳理缺血性心脏病指的是因冠状动脉血流与心肌需求不平衡而造成的心肌缺血性损伤,传统的医学干预措施主要包括药物干预、冠状动脉内溶栓干预与冠状动脉内支架干预等,对缺血性心脏病患者新血管形成相关的医学干预应用和研究均较为罕见。血管内皮祖细胞在血管新生与血管内皮损伤后修复中均有着重要的作用。作为一种天然的抗氧化剂,白藜芦醇能够降低血液黏稠度,保持血液畅通,近年来,白藜芦醇对缺血性心脏病患者的影响机制研究逐渐增多。本次研究主要探讨分析白藜芦醇对缺血性心脏病患者血管内皮祖细胞的影响机制。
杜晓龙[8](2019)在《miR-150对内皮祖细胞分化的影响和调控机制的实验研究》文中研究表明深静脉血栓形成(Deep vein thrombosis,DVT)是较为常见的外周血管系统疾病之一,深静脉血栓的发生多是由于血管内皮损伤、血流动力学改变及血液异常高凝状态等原因所导致。其中急性期下肢血栓如发生脱落,则有引起肺动脉栓塞(pulmonary embolism,PE)的风险,死亡率较高,严重威胁患者的生命健康。如短期内血栓无法全部清除则发生血栓机化,远期发展为血栓形成后综合征(post-thrombotic syndrome,PTS),其表现为下肢疼痛肿胀、皮肤色素沉着、感觉异常、下肢皮肤反复溃疡等临床表现,严重影响患者生活质量。目前临床上常用的治疗方法包括单纯抗凝治疗、手术取栓、微创介入治疗等。虽然这些治疗手段对于急性期的血栓有着较好的疗效,但对于慢性期血栓以及血栓机化后造成的内皮损伤治疗效果有限。干细胞是目前缺血性疾病的研究热点之一,其中内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)作为内皮细胞的前体细胞,具有定向分化为成熟内皮细胞的潜在能力,在新生血管形成以及受损内皮修复的过程中发挥重要作用。已有的研究已经证明在深静脉血栓发生之后内皮祖细胞可以定向迁移至血栓部位,参与到血栓中血管新生,但由于内皮祖细胞在正常人体循环中含量较少且内皮祖细胞本身增殖能力较弱等一些特点,目前内皮祖细胞在临床上的应用仍然受到一定的限制。因此,如何提高内皮祖细胞在循环中的含量,增强内皮祖细胞的生物学功能,从而提高内皮祖细胞在体内发挥作用是目前的研究热点。此外,内皮祖细胞根据出现时间、细胞形态、表面标志物等不同可分为早期内皮祖细胞(Early endothelial progenitor cells,eEPCs)和晚期内皮祖细胞(Late endothelial progenitor cells,lEPCs),这两种细胞为内皮祖细胞的不同分化时期所产生,两者在增殖、成血管、旁分泌能力上均有不同。因此早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞在对血栓溶解再通过程中所发挥的作用也不一样,但目前对于两者在这一过程中的具体功能还不十分清楚。非编码核糖核苷酸(non-coding RNA,ncRNA)是指各种不翻译成蛋白质的RNA分子。这些RNA都可以从基因组转录而来,但不进行翻译过程,可在RNA水平行使各自的功能。非编码RNA主要包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及microRNA等。其中微小RNA(microRNA,miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用。目前的研究表明哺乳动物中大约30%的基因受到miRNA的调控。miRNA在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。我们前期的研究也发现了一些miRNA可以参与内皮祖细胞的生物学功能调节,因此本实验中我们重点探究了 miRNA-150对内皮祖细胞分化过程的影响以及对生物学功能的调节作用,并对内皮祖细胞移植后对血栓的机化再通作用进行了进一步的探讨。本研究丰富了内皮祖细胞功能调节以及移植治疗血栓作用的理论基础,并为深静脉血栓及其他缺血性疾病的细胞治疗研究提供了重要的理论依据。本次研究主要分为以下五个部分:第一部分 人外周血来源早期及晚期内皮祖细胞的培养及鉴定目的:验证成人外周血来源早期及晚期内皮祖细胞的分离、培养和鉴定方法,为后续体内及体外实验提供纯度较高的实验工具细胞。方法:抽取健康成年人外周血60 ml,采用密度梯度离心法分离获得成人外周血来源的单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs),再利用差速贴壁法定向诱导培养出内皮祖细胞,通过细胞形态学特征、细胞表面标志物以及Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色验证所获得细胞为内皮祖细胞。结果:通过密度梯度离心法获得单个核细胞继续培养1天后可见少量细胞贴壁,呈现出椭圆形、圆形,大小不一;贴壁细胞继续培养5-7天以后,镜下可见细胞集落形成,集落中间细胞呈圆形,周围细胞呈现长梭形或不规则形;细胞培养至14-21天后,可见细胞铺满培养板,细胞集落消失,细胞呈典型鹅卵石样外观。Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色显示细胞可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1。流式细胞学检测细胞表面标志物发现培养细胞可表达CD34、VEGFR2、CD133、CD31、CD45、CD14、vWF等。结论:密度梯度离心法结合差速贴壁法可以得到人外周血来源的内皮祖细胞,所获细胞符合EPCs特点的形态学特点,Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色以及流式细胞学检测进一步证实所获细胞纯度较高,能够满足后续实验要求。第二部分 miR-150对内皮祖细胞分化及生物学功能的影响目的:探讨miR-150对内皮祖细胞的分化及生物学功能的影响。方法:1.分别收集不同培养阶段的内皮祖细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应监测早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞中miR-150的表达水平。2.分别调控早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞中miR-150的表达含量,使用lipofectamine 3000将miR-150 模拟物(miR-150 agomir)以及 miR-150 抑制物(miR-150 antagomir)转染入细胞中,再次检测早期内皮祖细胞及晚期内皮祖细胞中miR-150的表达水平。3.使用体外及体内成血管实验、增殖实验等检测表达调控后的内皮祖细胞的增殖、迁移以及成血管能力。结果:l.miR-150在早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞中表达水平不同,与早期内皮祖细胞相比,晚期内皮祖细胞中miR-150表达水平显着提高;2.体外及体内成血管实验显示早期内皮祖细胞高表达miR-150后,其成血管能力显着提高,而晚期内皮祖细胞中抑制miR-150表达,其成血管能力有所下降;3.增殖实验也显示出相较于早期内皮祖细胞未处理组,当细胞中miR-150表达水平升高时,其增殖能力提升,而晚期内皮祖细胞中miR-150表达水平降低后,其增殖能力受到抑制;4.旁分泌实验检测IL-8以及VEGF,结果显示早期内皮祖细胞中增加miR-150表达水平后,其IL-8以及VEGF分泌能力下降,晚期内皮祖细胞中抑制miR-150表达水平后,其表达水平未有上升。结论:l.miR-150在内皮祖细胞分化不同阶段中表达水平不同;2.miR-150在内皮祖细胞中表达水平升高可促进其成血管能力提升;3.miR-150在内皮祖细胞中表达水平提高与其增殖能力提升有关;4.miR-150在内皮祖细胞中水平升高可抑制早期内皮祖细胞分泌VEGF以及IL-8。第三部分 miR-150调控内皮祖细胞分化的机制研究目的:研究miR-150调控内皮祖细胞分化的具体作用机制。方法:1.分别调控早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞中miR-150的表达含量,使用 lipofectamine 3000 将 miR-150 模拟物(miR-150 agomir)以及 miR-150 抑制物(miR-150 antagomir)转染入细胞中,提取不同组细胞中总蛋白,采用western blot检测不同组细胞中 pSer473 Akt、total Akt、pSer256 FOXO1 以及 total FOXO1 的蛋白含量;2.将早期内皮祖细胞与Akt信号通路阻断剂wortmannin共培养后采用流式细胞学检测内皮祖细胞表面标志物变化;3.采用体外成血管实验检测早期内皮祖细胞与wortmannin共培养后成血管能力改变;4.采用增殖实验检测早期内皮祖细胞与wortmannin共培养后增殖能力改变;5.ELISA实验检测早期内皮祖细胞与wortmannin共培养后旁分泌能力改变情况。结果:1.Western blot结果显示晚期内皮祖细胞中Akt表达水平高于早期内皮祖细胞,提高早期内皮祖细胞中miR-150的表达水平后,pSer473 Akt表达水平升高,加入Akt通路抑制剂wortmannin后Akt磷酸化水平受到抑制,此外,晚期内皮祖细胞中FOXO1表达水平高于早期内皮祖细胞,提高早期内皮祖细胞中miR-150表达后FOXO1磷酸化水平升高,反之,抑制Akt通路后,FOXOl磷酸化水平降低;2.细胞流式学检测发现早期内皮祖细胞中加入wortmannin后其表面标志物发生改变;3.体外成血管实验发现阻断Akt通路后可降低内皮祖细胞的成血管能力;4.增殖实验结果提示加入wortmannin后可抵消miR-150对于早期内皮祖细胞的促增殖作用;5.旁分泌实验结果显示加入wortmannin后可抵消miR-150对于早期内皮祖细胞旁分泌能力的抑制作用。结论:I.Akt/FOXO1信号通路参与调控内皮祖细胞的分化过程;2.阻断Akt/FOXOl信号通路后可抑制miR-150对于早期内皮祖细胞的生物学调节功能。第四部分 miR-150靶基因预测和验证目的:预测及验证miR-150在调控内皮祖细胞分化中可能的靶基因。方法:1.利用生物信息学预测miR-150可能的靶基因;2.western blot检测早期以及晚期内皮祖细胞中靶基因的蛋白表达水平;3.荧光素酶报告基因实验、qPCR以及western blot验证miR-150靶基因;4.western blot检测内皮祖细胞中miR-150靶基因受到抑制后对于Akt/FOXO1信号通路的影响。结果:1.生物信息学预测c-Myb为miR-150可能的靶基因;2.western blot结果显示早期内皮祖细胞中c-Myb表达水平高于晚期内皮祖细胞;3.荧光素酶报告基因实验显示miR-150可与含有c-Myb 3’UTR区质粒结合降低荧光强度,qPCR以及western blot检测发现miR-150升高可降低c-Myb的表达水平;4.western blot结果进一步发现c-Myb可以参与调控内皮祖细胞中Akt/FOXOl信号通路。结论:1.c-Myb为miR-150的靶基因;2.c-Myb参与调控内皮祖细胞中Akt/FOXOl信号通路。第五部分 早期内皮祖细胞及晚期内皮祖细胞对静脉血栓溶解再通的影响目的:研究不同分化阶段内皮祖细胞对静脉血栓溶解再通的影响。方法:1.建立裸大鼠深静脉血栓模型,将所建立模型分为五组:A组(10只),空白对照组,经尾静脉注入lml PBS;B组(10只),eEPCs组,经尾静脉注入lml含有l×106早期内皮祖细胞的细胞悬液;C组(10只),eEPCs/miR-150+lEPCs组,经尾静脉注入lml混合有l×106晚期内皮祖细胞以及上调miR-150表达的早期内皮祖细胞的细胞悬液;D组(10只),eEPCs/NC+lEPCs组,经尾静脉注入lml混合有1×106晚期内皮祖细胞以及早期内皮祖细胞的细胞悬液;E组(10只),lEPCs组,经尾静脉注入1ml晚期内皮祖细胞的细胞悬液。2.术后7天收集血栓标本,通过HE染色检测炎症细胞聚集以及新生血管情况;血栓称重检测各组中血栓重量;免疫组化染色检测微血管形成情况;数字减影血管造影观察静脉血栓溶解再通情况。结果:1.HE染色比较各实验组中炎症细胞聚集以及血栓溶解再通情况,结果显示eEPCs/miR-150+lEPCs组中新生血管含量最多,溶解再通情况最好;2.称量各组中血栓标本,结果显示相对于空白对照组,各个细胞移植组中血栓重量均有不同程度减少,其中eEPCs/miR-150+lEPCs组中血栓重量最轻;3.免疫组化染色结果显示eEPCs/miR-150+lEPCs组中,CD34阳性管壁最多;4.数字减影血管造影比较各实验组下腔静脉造影剂,结果显示相较于空白对照组,各个细胞移植组中均有血流恢复再通,其中eEPCs/miR-150+lEPCs组血流恢复情况最好。结论:1.各个分化阶段的内皮祖细胞均可以促进静脉血栓的溶解再通;2.混合移植上调miR-150的早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞促进血栓溶解再通的效果最好。
陈江龙[9](2018)在《阻塞性黄疸TGR5激活抑制内皮祖细胞成血管活性》文中研究指明【研究目的】阻塞性黄疸存在着多种病理生理改变,本课题组前期研究发现阻塞性黄疸动物存在血管内皮的损伤及创伤修复延迟。血管新生是创伤修复及手术后伤口修复的重要环节,但是阻塞性黄疸是否直接抑制了创伤修复未见报道;而又是何种因素在血管内皮损伤中发挥作用也尚未清楚。既往有关创伤修复及血管新生的报道也多与内皮祖细胞相关,但多与血管新生经典VEGF信号通路相关;本研究旨在对阻塞性黄疸、胆汁酸与其膜受体对内皮祖细胞在缺血损伤修复中的作用进行研究。【研究方法】本课题的主要研究方法为:(1)分析阻塞性黄疸对皮损创伤伤口修复的影响,采用免疫荧光伤口处的血管新生情况;(2)采用缺血损伤的经典模型股动脉结扎分析阻塞性黄疸对缺血损伤修复的影响;(3)分别观察胆汁酸与胆红素对股动脉结扎后缺血损伤修复的影响;(4)体外分离培养原代内皮祖细胞并采用免疫荧光和流式细胞术等多种方法进行鉴定;(5)采用小干扰RNA对内皮祖细胞胆汁酸核受体FXR与膜受体TGR5分别进行干扰并采用Western blotting验证,然后采用胆汁酸进行孵育,观察内皮祖细胞的迁移与成管能力;(6)原代内皮祖细胞采用胆汁酸进行孵育后,PCR检测多种促血管新生因子的表达情况;(7)采用慢病毒对TGR5进行特异性的敲减,然后采用特异性激动剂激动,再将EPCs回输到股动脉结扎动物模型,验证TGR5在内皮祖细胞促缺血损伤及血管新生中的作用。【研究结果】1.阻塞性黄疸抑制皮损创伤的修复,且损伤后一周创伤处皮肤的CD31、Ki67及ILB4阳性密度在阻塞性黄疸组均低于假手术组;提示阻塞性黄疸对损伤修复存在抑制作用,且这种作用可能是通过抑制血管新生而产生的;2.采用股动脉结扎动物模型我们观察到阻塞性黄疸确实抑制了缺血损伤后的血管新生:阻塞性黄疸组术后3天、7天、14天的术侧血流恢复及14天时的术侧肢体肌肉血管内皮密度(ILB4荧光染色)均低于假手术组;3.分析阻塞性黄疸中的何种因素抑制缺血损伤后的血管新生,分别验证了胆汁酸和胆红素的作用后发现,胆汁酸腹腔注射可以抑制股动脉结扎小鼠术后血流灌注恢复,且术后14天术侧肢体肌肉血管内皮密度(ILB4荧光染色)显着低于空白对照组,而胆红素处理则没有这种现象。提示我们阻塞性黄疸对缺血损伤修复的抑制作用可能主要是胆汁酸起作用;4.体外分离培养原代内皮祖细胞,经多种方法鉴定细胞纯度在90%以上;5.内皮祖细胞胆汁酸孵育之后我们发现,胆汁酸膜受体TGR5激活可以抑制内皮祖细胞的迁移、成管和分化能力,特异性干扰胆汁酸膜受体TGR5后我们发现胆汁酸对内皮祖细胞迁移、成管和分化能力的抑制作用减弱了,而干扰胆汁酸核受体FXR则没有这种作用;6.采用胆汁酸孵育之后发现,原代内皮祖细胞VEGF-A、PDGF-B、FGF、CD31、IL-8等各种促血管新生的因子表达均降低;7.内皮祖细胞胆汁酸膜受体TGR5特异性敲减后我们发现,胆汁酸对内皮祖细胞促缺血损伤修复的抑制作用减弱了,TGR5敲减组细胞回输后3天、7天、14天的术侧血流灌注恢复明显快于对照组,术侧肌肉的血管内皮密度也高于对照组。【结论】本课题通过皮损创伤的动物模型发现阻塞性黄疸对创伤后伤口恢复存在抑制作用;进一步分析发现阻塞性黄疸对创伤修复的抑制作用是通过抑制血管新生而产生的;而在阻塞性黄疸引起的众多病理生理变化中又是胆汁酸在其中发挥着这种抑制作用。分别干扰内皮祖细胞胆汁酸膜受体与核受体后发现膜受体激活可抑制其迁移与成管能力;进一步实验发现胆汁酸可抑制EPCs的迁移及成管能力及多种促血管生成因子的表达;特异性激活EPCs中胆汁酸膜受体TGR5我们发现EPCs迁移、成管、促血管新生和损伤修复的能力均降低,敲减TGR5之后则增强。综上所述:胆汁酸可以通过激活其膜受体TGR5抑制内皮祖细胞成血管活性,从而抑制其促缺血损伤的修复能力。
廖肇福[10](2019)在《心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究》文中研究说明目的:(1)对心脏Telocytes(CTs)、心脏干细胞(CSCs)和骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗缺血性心肌梗死的疗效进行比较;(2)对CTs与CSCs不同的协同方式移植治疗缺血性心肌梗死的疗效进行比较;(3)对CTs分泌外泌体治疗缺血性心肌梗死的疗效及其机制进行研究;(4)对CTs外泌体所含的miRNA-21-5p治疗缺血性心肌梗死的疗效及其机理进行研究;(5)对不同细胞、CTs外泌体治疗和miR-21-5p治疗心肌梗死的疗效进行比较;(6)对CTs外泌体的蛋白组可能参与梗死心肌修复再生的可能机理进行生物信息学预测;(7)对年青与年老CTs表达基因的差异组学及随增龄相应通路改变进行研究。方法:(1)通过贴壁法分离得到MSCs,磁珠分选法分离得到CTs和CSCs,然后分别将总细胞量为5×105的CTs、CSCs、MSCs、4种不同的CTs协同CSCs的方式[(1)CTs与CSCs在Transwell系统中共培养48小时后,移植共培养后的CSCs(5×105个细胞)(CSCs-co);(2)移植正常培养的CTs(2.5×105个细胞)和低氧(5%O2)培养48 h的CSCs(2.5×105个细胞)(CTs+CSCs-hyp);(3)移植正常培养的CTs(2.5×105个细胞)和在Transwell中与CTs共培养48 h后的CSCs(2.5×105个细胞)(CTs-nor+CSCs-co);(4)移植CTs(2.5×105个细胞)和CSCs(2.5×105个细胞)混合培养48 h后的混合细胞(CTs+CSCs-co)]及PBS移植到利用左冠状动脉前降支(LAD)结扎术构建的心肌梗死大鼠的心肌层中。细胞心肌内移植4周后,使用超声心动图评价心功能;使用Masson’s trichrome染色,对各组心肌梗死面积、心脏纤维化程度、左心室室壁厚度进行半定量比较分析;使用抗v WF免疫组化染色对各组梗死区和梗死边缘区的血管密度进行半定量分析比较;使用抗PH3和α-SA,抗Ki67和Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色对各组梗死区和梗死边缘区的增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和CD34,及抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区存活的CTs和CSCs密度进行半定量分析;(2)使用透射电镜观察大鼠心肌层的CTs及CTs分泌的外泌体。通过心肌内注射移植CTs外泌体到LAD结扎的大鼠梗死心肌层中,4周后使用超声心动图对CTs分泌外泌体治疗组和PBS对照组的心功能进行评价分析;使用Masson’s trichrome染色,对心肌梗死面积、心脏纤维化程度、左心室室壁厚度进行半定量分析;使用抗α-SMA和抗MMP2的免疫荧光染色分别对各组梗死区成肌成纤维细胞密度和MMP2的表达量进行半定量分析;使用抗v WF的免疫组化染色和抗Ki67与Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区与梗死边缘区的血管密度和增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区存活的CSCs密度进行半定量分析;把经Di I染色的CTs分泌外泌体与CSCs进行共孵育,以观察CTs分泌外泌体是否能进入CSCs;使用流式细胞技术、死活细胞染色和CCK8分别对CTs分泌外泌体对缺血缺氧环境中的CSCs可能的保护作用进行分析;(3)使用qPCR对与CTs共培养48小时的CSCs中的miR-21-5p表达水平进行定量分析。通过心肌内注射miR-21-5p agomir和无关序列对照至LAD结扎致心梗的大鼠缺血心肌层中,7天后利用超声心动图对心功能进行评价;使用Masson’s trichrome染色对心肌梗死面积进行半定量分析比较;使用抗Ki67和Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色对各组梗死区和梗死边缘区的增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色对各组梗死区存活的CSCs进行半定量分析。使用生物信息学预测miR-21-5p潜在靶基因,并利用qPCR和双荧光素酶报告系统确认miR-21-5p的靶基因,并使用针对靶基因的siRNA对miR-21-5p靶基因及功能进行研究。(4)通过单因素方差分析比较不同细胞、CTs外泌体和miR-21-5p治疗心肌梗死的射血分数、缩短分数、左心室收缩和舒张末期直径和梗死面积,以比较相应的疗效。(5)使用蛋白质非标记定量质谱技术和Ingenuity Systems Pathway Analysis(IPA)生物信息学系统对常氧和低氧环境下,CTs分泌外泌体参与心肌修复与再生的功能因子进行分析。(6)通过基因芯片和IPA生物信息学系统对年老和年青CTs差异表达的基因可能参与调控心血管生理与病理与通路进行分析。结果:(1)CTs,MSCs和CSCs分别对心梗治疗的疗效比较:心功能指标,CTs治疗组的射血分数、缩短分数、左心室收缩和舒张末期直径相比MSCs组和CSCs组差异均无显着性统计学意义(P>0.05);梗死面积,CTs治疗组的梗死面积显着小于MSCs组(P<0.05),与CSCs组的差异没有显着性统计学意义(P>0.05);心脏纤维化指标,CTs治疗组的梗死区胶原面积和梗死对侧区的血管周边胶原面积均分别显着小于MSCs组和CSCs组(P<0.05);左心室重构指标,CTs治疗组的梗死区边缘厚度和最小厚度与MSCs组和CSCs组差异均无显着性统计学意义(P>0.05);血管新生,CTs治疗组的梗死区血管密度分别显着性大于MSCs组和CSCs组(P<0.05),CTs治疗组的梗死边缘区血管密度显着性大于MSCs组(P<0.05),而和CSCs组的差异没有显着性统计学意义(P>0.05);梗死区和边缘区的心肌增殖,CTs治疗组的PH3阳性心肌或Ki67阳性的心肌数与MSCs组和CSCs组的差异无显着性统计学意义(P>0.05);梗死区CSCs和CTs的密度,CTs治疗组的梗死区CTs密度和CSCs密度分别与MSCs组和CSCs组相比,差异无显着性统计学意义(P>0.05)。(2)4种不同协同方式的CTs和CSCs治疗对心梗治疗的疗效比较:心功能指标,4种不同协同方式的CTs和CSCs治疗组中只有CTs+CSCs-co治疗组的射血分数和缩短分数分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组(P<0.01),左心室收缩末期直径分别显着小于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组(P<0.05),左心室收舒张期直径分别显着小于单独移植CTs组和MSCs组(P<0.05),但与CSCs组的差异没有显着性统计学意义(P>0.05);梗死面积,4种不同协同方式的CTs组和CSCs治疗组中只有CTs+CSCs-co治疗组的梗死面积分别显着小于单独移植CTs、CSCs和MSCs组(P<0.05);心脏纤维化指标,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区胶原面积分别显着小于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组(P<0.05),梗死对侧区血管周边胶原面积分别显着小于单独移植CSCs组和MSCs组(P<0.01),但与CTs组的差异没有显着性统计学意义(P>0.05);左心室重构指标,CTs+CSCs-co治疗组的梗死边缘厚度与CTs组、CSCs组和MSCs组差异均无显着性统计学意义(P>0.05),而梗死区最小厚度分别显着大于CSCs组和MSCs组(P<0.05),但与CTs组差异没有显着性统计学意义(P>0.05);血管新生,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区和梗死边缘区的血管密度均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组(P<0.01);梗死区和边缘区心肌增殖,CTs+CSCs-co治疗组的PH3阳性心肌或Ki67阳性的心肌数均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组(P<0.05);梗死区CSCs和CTs的存活,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区CTs密度和CSCs密度均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组(P<0.05)。(3)通过透射电镜在大鼠心肌层观察到典型形态的CTs及其分泌的外泌体;心肌注射CTs外泌体对心梗治疗的疗效:心功能指标,CTs外泌体治疗组的射血分数和缩短分数分别显着大于PBS对照组(P<0.05),左心室收缩末期直径显着小于PBS组(P<0.01),左心室舒张末期直径与PBS组的差异没有显着性统计学意义(P>0.05);梗死面积,CTs外泌体治疗组的梗死面积显着小于PBS组(P<0.05);心脏纤维化指标,CTs外泌体治疗组的梗死区胶原面积、梗死对侧区的血管周边胶原面积以及梗死区成肌成纤维细胞密度均显着小于PBS组(P<0.01);左心室重构指标,CTs外泌体治疗组的梗死边缘厚度显着大于PBS对照组(P<0.05),但最小厚度与PBS组的差异没有统计学意义(P>0.05),梗死区的MMP2的表达量显着低于PBS对照组(P<0.01);血管新生,CTs外泌体治疗组的梗死区血管密度显着大于PBS对照组(P<0.05),但梗死边缘区血管密度与PBS对照组相比差异没有显着性统计学意义(P>0.05);梗死区和边缘区心肌增殖,CTs外泌体治疗组的Ki67阳性的心肌数显着大于PBS组(P<0.01);梗死区CSCs的存活,CTs外泌体治疗组的CSCs密度显着大于PBS组(P<0.01);经Di I染色的CTs外泌体能被CSCs摄取,并且发现CSCs经CTs外泌体预处理2 h后相比PBS对照组能显着减少缺血缺氧环境中CSCs的凋亡率和显着提高CSCs的存活率(P<0.05)。(4)与CTs共培养48 h后CSCs的miR-21-5p的表达量显着升高(P<0.01);心肌注射miR-21-5p对心梗治疗的疗效:心功能指标,miR-21-5p治疗组的射血分数和缩短分数均显着大于无关序列对照组(P<0.05),左心室收缩和舒张末期直径均显着小于无关序列对照组(P<0.05);梗死面积,miR-21-5p治疗组的梗死面积显着小于无关序列对照组(P<0.05);梗死区和边缘区的心肌增殖,miR-21-5p治疗组的Ki67阳性的心肌数显着大于无关序列对照组(P<0.05);梗死区CSCs存活,miR-21-5p治疗组的CSCs密度均显着大于无关序列对照组(P<0.05);CSCs过表达miR-21-5p后能显着减小在缺血缺氧环境中的凋亡率(P<0.05)。通过生物信息学预测、q-PCR和双荧光素酶报告细胞验证Cdip1是miR-21-5p的靶基因,通过Cdip1的siRNA沉默CSCs中Cdip1的表达能显着减少CSCs在缺血缺氧环境中的凋亡(P<0.05)。(5)通过比较不同细胞治疗、CT外泌体治疗和miR-21-5p治疗三种疗法对心梗大鼠的心功能和梗死面积,发现所有的细胞治疗组与注射CTs外泌体及注射miR-21-5p治疗组的射血分数、缩短分数相比PBS对照组均显着增加(P<0.05),而梗死面积显着减小(P<0.05)。而三种治疗心肌梗死的疗法中CTs+CSCs-co组的射血分数和缩短分数最大,梗死面积最小。(6)蛋白质非标记定量质谱技术在常氧和低氧CTs分泌的外泌体中检测到450种和454个蛋白,通过IPA分析揭示这些蛋白可能参与血管新生、心脏纤维化、细胞增殖和细胞死亡与存活等去影响心肌梗死进程。(7)通过比较分析老年CTs与年青CTs的表达芯片,发现老年CTs相比年青CTs表达量上调有注释的基因有1948个,表达量下调有注释的基因有1407个,IPA分析揭示老年CTs相比年青CTs表达有显着性差异的基因和显着性差异在5倍以上的基因都与Cardiovascular system development and function和Cardiovascular disease高度相关。结论:(1)移植CTs治疗心肌梗死,在减少梗死面积和心脏纤维化与促进血管新生方面略优于单独移植CSCs和MSCs;(2)4种CTs与CSCs协同治疗方式中CTs+CSCs-co对心肌梗死的疗效最佳,并且在改善心功能,减小梗死面积和心脏纤维化,促进血管新生、心肌增殖、CTs网络重构及CSCs的存活方面优于单独移植CTs、CSCs和MSCs治疗;(3)使用CTs分泌的外泌体对心梗进行治疗能显着改善心梗心脏的心功能,减小梗死面积和心脏纤维化,改善左心室重构,促进血管新生、心肌增殖以及CSCs的存活;(4)心肌内注射miR-21-5p对心梗进行治疗能显着减小梗死面积,促进心肌增殖和CSCs存活,miR-21-5p保护CSCs的机制之于是通过下调靶基因Cdip1的表达减少缺血缺氧环境中CSCs的凋亡;(5)三种治法(细胞、CTs外泌体和miR-21-5p)对心梗的治疗中,CTs+CSCs-co组治疗的疗效相对最佳;(6)CTs分泌外泌体所含的蛋白因子可能参与梗死心肌的再生;(7)老年CTs相比年青CTs表达差异的基因可能参与心脏衰老和心血管疾病的发生。
二、内皮祖细胞与血管新生(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、内皮祖细胞与血管新生(论文提纲范文)
(1)人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
课题设计 |
第一部分 外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备 |
一、材料和方法 |
二、结果 |
第二部分 ~(uMSC)EXOs促进骨修复的动物体内实验 |
一、材料和方法 |
二、结果 |
第三部分 ~(uMSC)EXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验 |
一、材料和方法 |
二、结果 |
第四部分 ~(uMSC)EXOs促进血管新生的机制探索 |
一、材料和方法 |
二、结果 |
分析与讨论 |
结论及意义 |
综述一:干细胞衍生外泌体:一种促进骨折愈合的有效策略 |
综述二:基于水凝胶的支架在组织工程应用中的生物相容性 |
参考文献 |
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
致谢 |
(2)黄芪甲苷促人内皮祖细胞分泌血管生长因子的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
缩略词 |
引言 |
第一部分 材料与方法 |
1 材料与仪器 |
2 实验操作方法 |
3 观测指标及检测方法 |
4 数据的统计与分析 |
第二部分 实验结果 |
1 原代EPCs的培养 |
2 原代EPCs的鉴定结果 |
3 各个血管生长因子OD值的测定及标准曲线的绘制 |
4 各血管生长因子的浓度及对比 |
结论 |
讨论 |
1 血管新生与内皮祖细胞及血管生长因子的关系 |
2 内皮祖细胞与内环境的关系 |
3 黄芪甲苷与血管新生 |
4 中医药对EPCs功能的影响 |
5 创新、不足与展望 |
致谢 |
参考文献 |
综述 中医药促进内皮祖细胞功能的研究进展 |
参考文献 |
(3)自体骨髓源性内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的临床研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 前言 |
1. 脑卒中概况 |
2. 干细胞与脑卒中 |
3. BMSCs与脑卒中 |
4. EPCs与脑卒中 |
5. 研究设计 |
参考文献 |
第二章 自体骨髓源性内皮祖细胞移植对急性期缺血性脑卒中的安全性评价及初步疗效评估 |
2.1 目的 |
2.2 研究方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
参考文献 |
第三章 自体骨髓源性内皮祖细胞移植对慢性期缺血性脑卒中的安全性评价及初步疗效评估 |
3.1 目的 |
3.2 研究方法 |
3.3 结果 |
3.4 讨论 |
参考文献 |
全文小结 |
英文缩略词表 |
附图 |
附表 |
综述 |
参考文献 |
在读期间成绩 |
致谢 |
(4)WKYMVm与YIGSR双肽协同作用对骨缺损修复影响及其机制的初步探讨(论文提纲范文)
缩略语表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
第一章 前言 |
第二章 原代大鼠EPCs分离、纯化、鉴定 |
2.1 仪器设备 |
2.2 实验结果 |
2.3 讨论 |
2.4 结论 |
第三章 WKYMVm与YIGSR两种生物多肽联用对EPCs 细胞行为的影响研究 |
3.1 仪器设备 |
3.2 实验结果 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 WKYMVm与 YIGSR促进EPCs细胞行为改变的机制初步研究 |
4.1 材料与方法 |
4.2 实验结果 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 WKYMVm通过FPR2 体外对破骨细胞分化成熟及骨吸收功能的影响 |
5.1 材料与方法 |
5.2 实验结果 |
5.3 讨论 |
5.4 小结 |
第六章 WKYMVm与 YIGSR联合作用促进大鼠股骨缺损修复 |
6.1 材料与方法 |
6.2 实验结果 |
6.3 讨论 |
6.4 小结 |
全文结论 |
参考文献 |
文献综述 仿生多肽在骨修复当中的应用与前景 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的论文 |
学位论文自评表 |
致谢 |
(5)MiR-205调控内皮祖细胞血管新生和溶栓作用的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
材料与方法 |
1. 实验材料 |
1.1. 实验动物 |
1.2. 实验试剂及耗材 |
1.3. 手术器械及仪器 |
2. 实验方法 |
2.1. 体外实验方法 |
2.2. 体内实验方法 |
3. 统计分析 |
结果 |
1. 内皮祖细胞感染效率的检测 |
2. miR-205对内皮祖细胞生物学功能的影响 |
2.1. miR-205对内皮祖细胞成血管能力的影响 |
2.2. miR-205对内皮祖细胞迁移和侵袭能力的影响 |
2.3. miR-205对内皮祖细胞增殖能力的影响 |
2.4. miR-205对内皮祖细胞凋亡情况的检测 |
3. miR-205对内皮祖细胞体内血管新生能力的影响 |
4. miR-205对内皮祖细胞用于DVT治疗效果的评估 |
5. miR-205调控内皮祖细胞的机制探讨 |
5.1. miR-205调控内皮祖细胞中PTEN的表达 |
5.2. 双荧光素酶报告基因验证PTEN为miR-205的靶点 |
5.3. 共转染miR-205和PTEN对内皮祖细胞迁移、侵袭和成血管能力的影响 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间的学术成果 |
英文缩略词 |
致谢 |
(6)血管生长因子AGGF1通过增强内皮祖细胞功能治疗糖尿病小鼠后肢缺血(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 引言 |
1.1 糖尿病 |
1.2 内皮祖细胞 |
1.3血管新生与AGGF1 |
1.4 研究意义 |
2 材料和方法 |
2.1 实验相关仪器 |
2.2 实验相关软件 |
2.3 实验小鼠 |
2.4 细胞系和细胞培养 |
2.5 内皮祖细胞的分离与培养 |
2.6 内皮祖细胞的鉴定 |
2.7 抗体 |
2.8 鼠尾DNA提取与基因型PCR鉴定 |
2.9 Ⅱ型糖尿病模型的高脂肪食物诱导 |
2.10 小鼠后肢缺血模型的建立 |
2.11 慢病毒的包装与感染 |
2.12 管腔形成实验(tube formation assay) |
2.13 细胞增殖实验 |
2.14 跨内皮迁移实验 |
2.15 划痕实验 |
2.17 细胞siRNA转染 |
2.18 重组人AGGF1蛋白的诱导表达纯化 |
2.19 RNA提取及c DNA第一链合成 |
2.20 实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR) |
2.21 免疫印迹试验(Western blot) |
2.22 免疫组织化学检测 |
2.23 数据分析 |
3 结果 |
3.1 骨髓单个核细胞的分离与向内皮祖细胞的诱导培养、鉴定 |
3.2 AGGF1可能参与内皮祖细胞的分化 |
3.3 AGGF1是内皮祖细胞促血管新生功能必需的 |
3.4 AGGF1对高葡萄糖条件下内皮祖细胞功能失常具有保护作用 |
3.5 AGGF1促进Ⅱ型糖尿病小鼠后肢缺血模型中内皮祖细胞介导的血管新生与血流恢复 |
3.6 AGGF1在内皮祖细胞中拮抗高糖诱导的氧化应激 |
3.7 AGGF1 通过Akt/Fyn/Nrf2 信号通路参与内皮祖细胞氧化应激 |
3.8 敲低Akt表达,Wortmannin处理和敲低Nrf2 表达可降低AGGF1 依赖性的EPCs促血管新生功能 |
4 讨论 |
5 总结和展望 |
致谢 |
参考文献 |
附录Ⅰ 攻读学位期间发表论文目录 |
本文中所用的英文缩略语对照表 |
(7)白藜芦醇对缺血性心脏病患者血管内皮祖细胞的影响机制(论文提纲范文)
1 缺血性心脏病患者新血管形成机制 |
2 内皮祖细胞生物学特性 |
3 内皮祖细胞对改善缺血性心脏病患者新血管形成的影响 |
3.1 内皮祖细胞对改善缺血性心脏病患者新血管形成的影响 |
3.2 内皮祖细胞对改善缺血性心脏病患者新血管形成的影响的分子机制 |
4 白藜芦醇对缺血性心脏病患者血管内皮祖细胞的影响机制 |
5 结 语 |
(8)miR-150对内皮祖细胞分化的影响和调控机制的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 人外周血来源早期及晚期内皮祖细胞的培养及鉴定 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第二部分 miR-150对内皮祖细胞分化及生物学功能的影响 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第三部分 miR-150调控内皮祖细胞分化的机制研究 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第四部分 miR-150靶基因预测和验证 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第五部分 早期内皮祖细胞及晚期内皮祖细胞对静脉血栓溶解再通的影响 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
结论 |
研究创新与不足 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
英文缩略词表 |
攻读学位期间学术成果 |
致谢 |
(9)阻塞性黄疸TGR5激活抑制内皮祖细胞成血管活性(论文提纲范文)
中英文缩略词对照表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
1 实验材料 |
1.1 .实验动物 |
1.2 实验细胞 |
1.3 实验仪器设备和耗材 |
1.4 试剂配剂 |
1.5 主要试剂配方 |
2 实验方法 |
2.1 小鼠皮损创伤动物模型建立 |
2.2 小鼠股动脉结扎模型建立 |
2.3 流式细胞术 |
2.4 激光多普勒血流扫描 |
2.5 免疫荧光染色 |
2.6 免疫组织化学染色 |
2.7 免疫蛋白印记分析 |
2.8 实时定量荧光PCR |
2.9 原代细胞分离培养 |
2.10 小干扰RNA干扰实验 |
2.11 细胞划痕实验 |
2.12 细胞成管实验 |
2.13 细胞Transwell实验 |
2.14 细胞回输实验 |
2.15 统计分析 |
3 实验结果 |
3.1 阻塞性黄疸小鼠存在皮损创伤术后修复延迟现象 |
3.2 阻塞性黄疸抑制股动脉结扎后血管新生 |
3.3 胆汁酸而非胆红素抑制股动脉结扎术后血流灌注与组织血管密度 |
3.4 体外分离培养内皮祖细胞并鉴定 |
3.5 胆汁酸作用于内皮祖细胞胆汁酸膜受体 TGR5 抑制内皮祖细胞迁移、分化与成管能力。 |
3.6 胆汁酸孵育抑制内皮祖细胞各种促血管新生因子表达 |
4 讨论 |
5 结论 |
6 参考文献 |
7 综述 |
综述参考文献 |
9 致谢 |
(10)心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词注释表 |
第一章 前言 |
1.1 心血管疾病的现状 |
1.2 心肌梗死 |
1.3 心肌梗死的治疗 |
1.4 细胞治疗 |
1.5 细胞外泌体(exosome)治疗 |
1.6 MicroRNA治疗 |
1.7 心脏Telocyte与心脏再生 |
1.8 本论文的主要研究内容 |
1.9 本论文的创新点 |
第二章 心脏Telocytes协同心脏干细胞对缺血性心肌梗死的疗效优于单独细胞移植 |
2.1 前言 |
2.2 材料 |
2.3 方法 |
2.4 结果 |
2.5 讨论 |
第三章 心脏Telocytes分泌外泌体对缺血性心肌梗死的疗效研究 |
3.1 前言 |
3.2 材料 |
3.3 方法 |
3.4 结果 |
3.5 讨论 |
第四章 心脏Telocytes外泌体内所含的miRNA-21-5p对缺血性心肌梗死的疗效研究. |
4.1 前言 |
4.2 材料 |
4.3 方法 |
4.4 结果 |
4.5 讨论 |
第五章 细胞、外泌体及miRNA对缺血梗死心肌疗效的相互比较 |
5.1 前言 |
5.2 方法 |
5.3 结果 |
5.4 讨论 |
第六章 心脏Telocytes分泌外泌体的蛋白组学研究 |
6.1 前言 |
6.2 材料 |
6.3 方法 |
6.4 结果 |
6.5 讨论 |
第七章 老年心脏 Telocytes与年青心脏 Telocytes基因表达芯片的比较与分析 |
7.1 前言 |
7.2 材料 |
7.3 方法 |
7.4 结果 |
7.5 讨论 |
第八章 全文总结 |
参考文献 |
特别鸣谢 |
硕博士期间发表论文清单 |
致谢 |
四、内皮祖细胞与血管新生(论文参考文献)
- [1]人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究[D]. 夏琰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]黄芪甲苷促人内皮祖细胞分泌血管生长因子的实验研究[D]. 王禹萌. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [3]自体骨髓源性内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的临床研究[D]. 方杰. 南方医科大学, 2020
- [4]WKYMVm与YIGSR双肽协同作用对骨缺损修复影响及其机制的初步探讨[D]. 胡峻贤. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [5]MiR-205调控内皮祖细胞血管新生和溶栓作用的研究[D]. 焦健. 苏州大学, 2019(06)
- [6]血管生长因子AGGF1通过增强内皮祖细胞功能治疗糖尿病小鼠后肢缺血[D]. 李勇. 华中科技大学, 2019(01)
- [7]白藜芦醇对缺血性心脏病患者血管内皮祖细胞的影响机制[J]. 刘洁,罗展雄. 中国临床研究, 2019(05)
- [8]miR-150对内皮祖细胞分化的影响和调控机制的实验研究[D]. 杜晓龙. 苏州大学, 2019(04)
- [9]阻塞性黄疸TGR5激活抑制内皮祖细胞成血管活性[D]. 陈江龙. 福建医科大学, 2018(09)
- [10]心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究[D]. 廖肇福. 暨南大学, 2019