一、冻干种毒在制备鸡传染性喉气管炎和鸡痘活疫苗生产中的应用（论文文献综述）
陈秀琴,郑敏,黄梅清,林苏,郑良焰,林锋强[1]（2021）在《禽类弱毒疫苗外源因子污染检测方法的研究进展》文中进行了进一步梳理近年来,我国已经发生数起禽类弱毒疫苗污染事件,给养禽业造成巨大的经济损失。应用合适的检测方法准确快速检测外源因子对确保疫苗产品安全至关重要。传统的检测法是公认的检测外源因子的标准方法,但存在一定的局限性,基于核酸的分子生物学方法逐渐成为更有优势的方法。文章就禽类弱毒疫苗污染外源因子的原因,外源因子传统检测技术、免疫学技术及分子生物学技术,检测外源因子不同方法的比较进行了综述,以期为预防和检测疫苗污染外源因子提供参考。
董炳梅[2]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中研究说明鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
楚电峰[3]（2018）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验》文中认为H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）对鸡的致病性低,仅引起轻微的呼吸道症状和短时间产蛋下降,但混合感染或继发感染其他病原可导致较高的发病率和死亡率。H9亚型禽流感对养鸡业危害较大,免疫接种是防控该病的主要策略之一。目前生产上常用的H9亚型禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗,这类疫苗仅能诱导产生高水平的循环抗体,而不能有效地激发细胞免疫和黏膜免疫应答。近年来,以火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey,HVT）为载体的重组病毒活疫苗已经成为研究热点。一方面,HVT具有较多的复制非必需区可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日龄雏鸡免疫或18日龄胚内注射免疫,能够更早地诱导免疫应答。本研究旨在以HVT为载体,构建能稳定表达H9亚型AIV血凝素（HA）的重组病毒活疫苗候选毒株,与现有灭活疫苗组合使用,以提供更加有效的免疫保护。1.rHVT-YBF003株的构建及其遗传稳定性与安全性评价重组病毒构建:对近年分离的21株H9亚型AIV进行HA基因测序和遗传进化分析,发现这些毒株处于h9.4.2.5分支,为目前H9亚型AIV的优势流行毒株。因此,本研究选取其中的YBF003株,用于重组病毒的构建。采用RT-PCR扩增H9亚型AIV YBF003株的HA基因,将HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV启动子的载体,构建转移载体pFR-H9。将pFR-H9与表达绿色荧光蛋白（EGFP）的重组HVT（rHVT-EGFP）基因组共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,以同源重组的方式将rHVT-EGFP的EGFP基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-YBF003株。在CEF单层上反复纯化rHVT-YBF003株,直至所有重组病毒空斑均不带绿色荧光。经PCR鉴定,HA基因表达盒正确插入到HVT基因组;进一步进行Western-blot和IFA鉴定,rHVT-YBF003株能够表达HA蛋白。分别用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,两者的生长特性并无显着差异。将rHVT-YBF003株在CEF上连续传20代,再接种于CEF单层,待形成典型空斑后,通过PCR从随机挑选的20个空斑中均能检测到HA基因表达盒;将第20代rHVT-YBF003株接种于CEF单层,通过间接免疫荧光试验（IFA）证明rHVT-YBF003株能够稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。重组病毒的遗传稳定性:1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日龄时,从血液中分离淋巴细胞,再接种于另一批次1日龄SPF鸡（3.0×106个淋巴细胞/羽份）。如此反复传代6次,经PCR检测传代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA证明传代后的重组病毒仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分离淋巴细胞,再接种于CEF单层,进行病毒分离和计数。结果显示,rHVT-YBF003株在鸡体内的病毒载量不断提高,至9周龄时,病毒载量达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能检测到少量重组病毒存在,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间。重组病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接种1日龄SPF鸡,对鸡群进行连续8周的临床观察、生长状况监测,结果显示接种重组病毒的试验鸡精神、采食、饮水均正常,剖检和组织切片检查均未发现病理变化。以5.0×104PFU/头份的rHVT-YBF003株接种4周龄ICR小鼠,接种后ICR小鼠的采食、精神均正常;接种后14天,对小鼠内脏器官检查并称重,显示接种重组病毒对小鼠无不良影响。因此,重组病毒对易感动物和非易感动物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力评价对SPF鸡的免疫保护效力试验:试验分为4组,分别为胚内免疫组、1日龄免疫组、灭活疫苗组和空白对照组;分别对18日龄SPF鸡胚胚内注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日龄SPF雏鸡皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日龄SPF雏鸡肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗（YBF003株）、1日龄SPF雏鸡皮下注射0.5 mLPBS/只。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒（静脉注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份）。28日龄时,胚内免疫组和1日龄免疫组的HI抗体效价分别为4.7±0.60和4.5±0.30,胚内免疫组比1日龄免疫组的HI抗体最大提高0.3±0.62个滴度,两组均能提供一定的早期保护;灭活疫苗组的HI抗体效价为6.5±0.75,攻毒保护率为50%;空白对照组的抗体为1.3±0.12,攻毒保护率为0%。对商品鸡的免疫保护效力试验:对商品鸡的分组及处理方式同SPF鸡。另外,增加重组病毒与灭活疫苗联合免疫组,该组于1日龄时颈部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日龄时经肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗（YBF003株）。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒（静脉注射1.0×107.5EID50/羽份）。28日龄时,胚内免疫组、1日龄免疫组和灭活疫苗免疫组的HI抗体效价分别为4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保护率均为50%以上,差异不显着;而联合免疫组的抗体效价为7.8±0.45,攻毒保护率为70%;空白对照组的抗体为1.0±0.74,攻毒保护率为10%。3.重组病毒种子批建立与大规模培养工艺研究培养工艺研究:为提高重组病毒的效价,同时获得规模化生产条件下的重组病毒培养技术参数。我们对采用细胞工厂进行大规模培养的方法进行了研究。结合该病毒的培养特性,分别从宿主细胞的接种密度、种毒接种剂量和收毒时间等方面对培养工艺进行摸索,最终制定了最优的病毒培养技术工艺:即采用十层细胞工厂（总面积为6335 cm2,培养液为1200mL）,CEF密度为2.5×106个/mL时,接种3.0×106PFU的重组病毒,培养72 h,收获感染细胞,按照每个细胞工厂分装50支冻存管的标准进行收获,每支冻存管分装量为1.8mL,其收获的病毒效价可达5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可达5000 PFU/羽份以上,远高于2000 PFU/羽份的国家标准。种子批建立:将所收获的重组病毒分为原始种子、基础种子和生产种子。原始种子包括重组病毒的F1～F6代,基础种子包括F7～F12代,生产种子包括F13～F17代。并在各级种子批中随机选取一个代次的种子进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、安全性检验、免疫原性检验和外源病毒检验。无菌检验和支原体检验中,三个代次种毒的检验结果均为阴性;鉴别检验中,对HVT鉴定部分采用间接免疫荧光试验,结果显示,三个代次种毒形成的病毒空斑均呈现绿色荧光,说明形成的病毒空斑为HVT,对HVT表达的HA蛋白鉴定采用Western-blot方法鉴定,结果显示,三个代次种毒均能表达HA蛋白;安全性检验中,三个代次的种毒接种1日龄SPF鸡,免疫剂量为3.0×104PFU/羽,免疫后观察90天,所有免疫鸡均未观察到临床症状;外源病毒检验中,分别于1日龄和21日龄时,采用滴鼻、点眼（剂量为3.0×104PFU/羽份）和肌肉注射（剂量为3.0×104PFU/羽份）三种途径同时接种重组病毒,42日龄时采集血清,均未检测到外源病毒的抗体。结果显示,三个代次的重组病毒均符合种毒质量标准。综上所述,本研究构建了一株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组HVT（rHVT-YBF003株）。在体内和体外传代过程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能稳定表达。在安全性评价方面,该重组病毒对易感和非易感动物均不具有致病性。该重组病毒可用于1日龄雏鸡和18日龄鸡胚内的早期免疫,虽然HI抗体低于灭活疫苗,但对H9亚型AIV的保护率等同于灭活疫苗。重组病毒与灭活疫苗联合使用具有协同效应,对H9防控效果更好。本研究还建立了种子批,并制定了符合大规模生产的重组病毒培养工艺,为将来工厂化生产打下了基础。
苗立中[4]（2018）在《鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价》文中指出鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是一种有重大经济影响且呈全球分布的家禽疾病。它由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起,是危害我国养禽业健康养殖的重要疫病。目前已有多种商品化疫苗用于IB的免疫预防,但由于IBV的高变异性、不同血清型之间缺乏交叉保护等原因,IB并未得到有效控制,IBV的综合防控仍然存在着大量难题。鉴于此,本研究对流行病学检测阳性样品进行IBV野毒株分离鉴定及其主要蛋白遗传变异性分析;并基于分离毒株建立IBV快速检测方法,包括荧光定量PCR检测方法和间接ELISA抗体检测方法,利用建立的检测方法对山东地区开展流行病学调查;对分离鉴定的部分毒株进行细胞培养条件的优化,确立最佳培养方法;利用细胞培养的病毒液配制灭活疫苗,探讨灭活疫苗的免疫效果,以期为IBV的早期诊断、流行病学调查、致病机制研究、遗传变异趋势研究、疫苗的制备和检验技术研究奠定基础,为山东地区IBV综合防控措施的制定提供科学依据。为对山东地区疑似IBV感染临床病例进行病原的分离与鉴定,并掌握分离毒株的生物学特性和遗传特征,本研究进行了病毒分离、血凝实验、鸡胚致病性、动物回归等系列试验。结果共获得分离毒株48株,对SPF鸡胚的EID50为10-5.0/0.1m L10-5.83/0.1 m L,均能引起SPF雏鸡表现典型的IBV感染症状,对SPF雏鸡的致死性介于30%60%,遗传进化分析显示48株分离毒株中有46株QX基因型,2株Mass基因型,表明QX基因型已成为山东地区IBV流行的优势基因型。基于分离QX基因型毒株建立IBV荧光定量PCR检测方法并组装试剂盒,检测分离毒株的器官嗜性和疫苗攻毒保护试验的排毒量,同时为IBV感染的早期诊断和流行病学调查提供新的检测方法。结果显示:该检测方法的标准曲线线性关系良好,相关系数R2为0.9988,可检测到7.5×103 copies/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;特异性检测结果显示检测MDV、NDV、IBDV、ILTV等其他禽源类病毒均为阴性;批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于3%;利用该试剂盒检测192份临床送检病料,检测出阳性样品48份,阳性率达25.0%（48/192）,显着高于普通PCR检测方法。以上结果表明IBV Real-time PCR试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好,可用于IBV的定量检测和IBV感染的早期诊断和流行病学调查。参照IBV S1基因序列,RT-PCR扩增分离毒株长约867 bp的S1基因主要抗原区域,将其克隆到p ET30α原核表达载体,转化Rossetta表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的IBV重组S1蛋白。在此基础上,将S1重组蛋白经纯化后作为抗原,建立了IBV间接ELISA抗体检测方法并组装了试剂盒,该试剂盒相对于IDEXX ELISA试剂盒的符合率、敏感性、特异性分别为94.55%,95.42%和92.96%,为后续疫苗抗体检测提供了技术支持,同时为临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供新的血清学诊断技术。为了确定分离毒株适于增殖的细胞系,本研究首先将IBV GQ/2015株、WF/2015株、M41株与M491株分别接种Vero、Vero-E6、BHK-21、Macr-145与DF-1细胞,并盲传至F5代,通过EID50的测定,确定最佳细胞系及其最适毒株;在此基础上,对细胞密度、增殖曲线等培养条件、病毒增殖促进剂的作用及小型生物反应器的应用进行了探索。结果显示,5种细胞中,仅Vero细胞适于4株IBV的增殖培养,且GQ/2015株与M491株增殖效果最佳,其毒价分别为10-4.83/0.1 m L与10-4.5/0.1 m L;而Marc-145、BHK-21与DF-1细胞只适于IBV某个毒株的增殖,且其毒价显着低于Vero细胞培养物。另一方面,对GQ/2015株与M491株增殖培养条件的优化的研究显示,GQ/2015株与M491株最适接毒量为细胞培养液的1%、最佳血清浓度为2%、最适接毒方式为分步接毒、最佳收毒时间为60 h72 h。最后应用固定床纸片载体生物反应器对GQ/2015与M491株进行增殖培养,结果显示,GQ/2015株与M491株的EID50可显着提高至10-6.375/0.1 m L与10-5.83/0.1 m L。因此本研究必将为实现应用细胞系增殖培养IBV的规模化生产提供参考。为开发针对IBV流行毒株的新型疫苗,本研究以IBV GQ/2015株为疫苗株,采用细胞培养方法制备病毒液,以白油为佐剂,研制了IBV油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全性好;疫苗免疫0.1 m L和0.3 m L后21 d间接ELISA抗体水平（S/P值）达到峰值,免疫0.5 m L后30 d间接ELISA抗体水平（S/P值）达到峰值;不同分离毒株交叉保护性试验显示该灭活疫苗对当前流行的IBV毒株具有非常好的交叉保护效果。表明IBV GQ/2015株油乳剂灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性,为研发具有自主知识产权的针对流行毒株的IBV疫苗奠定了基础。
纪依依[5]（2016）在《禽白血病标准抗原、标准抗体候选物的研制》文中研究指明禽白血病（Avian Leukosis,简称AL）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,简称ALV）感染引起的禽类各组织和脏器肿瘤。ALV现已分至A～K 11个亚群,A、B、C、D、E、J和K亚群分离自鸡。A～D和J、K亚群为外源性病毒,而E亚群是内源性禽白血病病毒,在许多品系鸡体内极普遍存在,低致病性或无致病性。为了建立禽白血病检测和净化规范,本研究开展了禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物和禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗、J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的研究,并以此作为生物学材料,对市场上相关试剂盒进行了检验,获得良好效果,为进一步净化禽白血病奠定了基础。一、禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的研制p27基因是禽白血病病毒A、B、C、D、J亚群和K亚群共同的高度保守的基因。本研究用表达禽白血病群特异性抗原GST-p27蛋白的pGEX-6p-1-p27重组菌进行诱导表达,对表达产物GST-p27进行了纯化,制备了ALV的重组GST-p27融合蛋白；同时扩增了J亚群禽白血病病毒JS09GY07株、A亚群禽白血病病毒AH10株；对这些候选物质进行了ELISA、PCR及IFA鉴定,同时通过一系列纯粹性、蛋白浓度、TCID50等标定,然后经过分装、物理性状检测及装量差异系数分析、细菌及支原体感染情况鉴定、均一性、稳定性以及保存时间的标定,分别制备出了禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物及其对应的弱阳性及阴性抗原,利用这些标准物质对市场上用于检测禽白血病群特异性抗原p27的试剂盒进行检验,发现市场上的试剂盒良莠不齐,提示在进行禽白血病检测及净化工作中选择市场上相应的试剂盒时应予以足够重视。二、禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗、J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的研制本研究分别复苏并扩增了针对禽白血病群特异性抗原p27蛋白的特异性单克隆抗体ALVp27-5D3杂交瘤细胞株及针对J亚群禽白血病特异性抗原gp85蛋白的单克隆抗体细胞株JE9,并分别将状态好的ALVp27-5D3杂交瘤细胞和JE9杂交瘤细胞腹腔注射6～8周龄的Balb/c雌性小鼠,大量制备ALVp27-5D3及JE9单克隆抗体腹水,并进行了纯化,制备了禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗候选物。用ALV-J通过肌肉注射途径对SPF鸡进行攻毒,五免十二天采血分离血清,作为J亚群禽白血病特异性标准血清候选物。用ALV-A通过腹腔注射、滴鼻点眼途径对SPF鸡进行攻毒,二免十二天采血分离血清,作为A亚群禽白血病特异性标准血清候选物。应用IFA、ELISA、Western blot等对制备好的禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗、J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物进行标定,然后进行分装、物理性状检测及装量差异系数分析,细菌及支原体感染、均一性、稳定性以及保存时间等一系列标定,最终获得了抗ALV-J和ALV-A的标准多抗血清和特异性标准单克隆抗体。分别将群特异性标准单抗候选物、J和A亚群禽白血病特异性标准血清的阳性、弱阳性及阴性抗体,对市场上检测禽白血病群特异性抗体、J和A亚群禽白血病特异性血清的试剂盒进行检验,发现市场上的试剂盒良莠不齐,在禽白血病检测及净化工作应予以高度重视。
宋娜[6]（2016）在《一株天鹅源小鹅瘟病毒的全基因序列分析及小鹅瘟病毒标准抗原抗体物质的制备》文中进行了进一步梳理1.一株天鹅源小鹅瘟病毒的全基因序列分析本研究利用鹅胚从江苏某动物园送检的病死天鹅病料中分离到一株小鹅瘟病毒,命名为GPV-XZ20150328,对该株病毒进行了全基因克隆测序,拼接后获得了GPV-XZ20150328的全基因序列。将其与GenBank上已发表的GPV全基因序列和本实验室分离的另一株天鹅源GPV全基因序列进行比较,结果显示：GPV-XZ20150328株全长为5106bp,与欧洲标准B株基因序列全长相同,同源性为97.7%,与天鹅源GPV-SHFX （5050bp）株的同源性达99.8%,但在末端重复序列其出现56个基因的插入,提示,GPV在不同个体和区域可能存在一定差异。2.小鹅瘟病毒标准抗原物质的制备本研究通过鹅胚接种扩增小鹅瘟病毒,用超速离心法进行纯化,通过SDS-PAGE分析、直接透射电镜观察、血凝试验、PCR特异性分析及灭活条件测定后,用聚乙二醇6000（PEG6000）浓缩法制得GPV浓缩抗原。结果表明,扩增的病毒纯度较高且无AIV、NDV、 EDS76、MDPV、ALV、MDV、IBV、ILTV、IBDV、REV、DEV、TMUV等病毒的污染。灭活条件以0.3%β-丙内酯作用48h最佳。制得的GPV浓缩抗原与特异性抗体反应的琼扩效价为1.4。将制备的浓缩抗原加入1%BSA冻存保护剂,分装,冻干后经物理性状检查、计算CV值、无菌检验、支原体检验、均一性、稳定性、保质期等检验后获得了高质量的标准抗原,可以用于相应检测试剂的质量判别。3.小鹅瘟病毒标准抗体物质的制备本研究采用口服和注射的途径对雏鹅进行四次免疫后制备了抗小鹅瘟多抗血清。利用本实验室保存的一株抗鹅细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株（GPV-Mab-6C8）经Bab/c小鼠制备出抗小鹅瘟单克隆抗体。用琼脂扩散试验检测,该多抗血清的AGP效价为1：64,用GPV细胞适应毒建立的免疫荧光检测方法（IFA）检测该血清,IFA效价为1：6400,单抗的IFA效价为1：1600。特异性鉴定结果表明制备的抗体物质只与GPV反应,而不与NDV、 AIV、EDS76、ALV、REV、IBV、IBDV、TMUV等病毒反应,证明特异性良好。将制备的抗体物质加入0.01%硫柳汞,分装,冻干后经物理性状检查、无菌检验、支原体检验、均一性、稳定性、保质期等检验后获得了高质量的标准抗体。
毛娅卿[7]（2014）在《禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析》文中提出禽白血病（Avian leukosis）是制约养禽业发展的主要禽类传染病,以垂直传播为主,免疫污染禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）的活疫苗也是引发该病的重要原因之一。目前主要通过定期对鸡群进行ALV血清学监测,采取淘汰净化的方法控制该病。我国开展ALV血清学监测通常使用美国IDEXX等公司的检测试剂盒,检测成本高、推广范围窄。因此,研究开发具有自主知识产权的ALV检测试剂盒,降低ALV检测成本,扩大鸡群检测范围,对我国防控本病有重要的实际应用意义。另外,ALV-J在临床上自报道以来一直处于不断的变异中,当前尚无确切证据证明ALV-J在我国鸡群中致病作用有多样性的机制,而病毒准种的多样性很有可能是ALV-J致病作用多样性的机制之一。因此,开展ALV准种研究对于从分子水平上解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性具有重要的理论意义。本研究通过原核表达ALV p27蛋白,制备抗p27蛋白多克隆抗体,建立了ALV抗原ELISA检测方法和ALV抗体ELISA检测方法。试验结果表明,建立的两种检测方法与禽常见传染病病毒或其阳性血清、大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性；两种方法的批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有良好的可重复性；ALV抗原ELISA检测方法与IDEXX公司的ALV抗原检测试剂盒敏感性相当,符合率达到98.9%；ALV抗体ELISA检测方法比IDEXX公司的ALVA/B和J亚群抗体检测试剂盒相对于间接免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率。利用本研究建立的抗原ELISA检测方法对918批不同疫苗进行了ALV检测,结果检测出63批外源性ALV污染疫苗。从2006年-2009年间污染的FPV. NDV和IBDV活疫苗中分别分离和鉴定到三株ALV,并对这三株ALV进行全基因组序列测定与分析。结果显示,三株ALV的gp85氨基酸序列与A亚群ALV参考毒株的gp85氨基酸序列同源性最高,为88.3%-97.7%,并且他们的全基因组整体同源性均较高；三株ALV与2009年分离自海兰褐祖代鸡的A亚群ALV中国分离株SDAU09C3同源性最高,显示它们很可能有共同的来源,也说明疫苗ALV污染是导致临床上鸡群发病的原因之一。从山东省某地方品系鸡疑似白血病发病鸡群分离到自然感染的血管瘤型ALV-J,并采用本研究建立的ALV抗原／抗体ELISA检测方法进行了抗原和抗体验证,同时选取LY1201株对其env基因进行了比较分析。结果证明ALV-J单一病毒株中存在差异极大的不同准种,发现gp85在氨基酸位点210-219发生10个连续的氨基酸缺失的准种,该缺失在此前我国ALV-J野毒株中均未发现,该研究说明可通过gp85序列测定进行ALV准种分析研究。在此基础上,将ALV-J LY1201株在DF-1细胞上连传3代后,扩增其gp85基因并对其20个阳性克隆子进行测序和准种分析,结果发现在20个克隆中gp85缺失的突变准种已经完全消失,原来的优势准种比例由33.3%上升为85.0%成为绝对优势准种。这表明ALV-J在适应细胞复制过程中病毒的准种组成是不断变化的,且发生突变的准种只有其复制能力高于原优势准种才可能具备竞争性优势。综上所述,本研究建立的ALV抗原/抗体ELISA检测方法,可用于ALV病毒检测和血清学监测,对于控制我国禽用病毒类活疫苗质量,加强禽白血病防控和净化具有重要的意义。目前本研究建立的ALV抗原ELISA检测方法已作为国家标准用于禽用病毒类活疫茁外源病毒检验。从禽用病毒类活疫苗中分离到污染的ALV,提示加强疫苗中ALV等外源病毒监测的重要性。同时,本研究建立的ALV-J准种分析方法,对于解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性提供了理论与技术支持。
郭彩云[8]（2012）在《鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87）国家参考品的研制》文中指出鸡传染性法氏囊病（Infectious of bursal disease, IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（Infectious of bursal disease virus, IBDV）引起的一种急性、高度传染性疾病。该病毒对雏鸡的淋巴组织尤其是法氏囊有很强的嗜性,通过攻击法氏囊内的B淋巴细胞而导致免疫抑制。因此该疾病的爆发会导致鸡群免疫失败和二次感染,对禽类养殖业危害极大,是家禽传染性疾病中危害最严重的疫病之一。在我国对该病的主要防治措施就是对鸡群进行疫苗免疫,而疫苗质量的好坏直接关乎免疫预防的成败。中等毒力活疫苗（B87株）一直作为国内生产使用最为广泛的鸡传染性法氏囊疫苗,但各厂家的疫苗质量参差不齐,疫苗质量不稳定,效力不均一,导致免疫效果也不一致。因此,急需相应的标准物质来使疫苗效力标准化,控制疫苗的质量,为鸡传染性法氏囊病的防控提供支持。在本研究中,通过对鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87株）国家参考品候选物的层层筛选,选定一批后分装冻干,再对其特性值进行协作标定,建立了一套鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87株）国家参考品的制备筛选方法,并最终制备得该参考品成品1000支。本研究,建立了检测鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87株）国家参考品效力的细胞间接免疫荧光方法,通过判定细胞的半数感染量（TCIDso）来确定参考品的效力,并与传统的鸡胚半数致死量（ELDso）进行相关性分析,相关系数r=0.823。本研究中还建立了检测IBDV的荧光定量RT-PCR方法,来测定疫苗中的病毒载量。本研究中采用鸡胚半数致死量（ELD50）方法组织单位对效力值进行协作标定,统计分析处理定值原始数据,将各协作单位分析测定的不确定度引入鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87株）国家参考品的定值结果中,得到更准确的、具有置信范围的定值结果。
周欣[9]（2012）在《激流式生物反应器大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗的研究》文中指出鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease Virus，IBD）是由IBD病毒（IBDV）引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。该病自20世纪80年代传入我国，至今仍是危害最为严重的禽病之一。目前，该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体，以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病。国内鸡传染性法氏囊病灭活疫苗通常是采用鸡胚成纤维细胞培养病毒制备而成，免疫效果差，在生产中应用效果不好。目前，国内各大种鸡场大多采用进口灭活疫苗。近年来，生物反应器大规模培养技术逐渐用于兽用生物制品。但目前对IBDV的研究不多，国内也有利用Vero细胞在生物反应器上增殖IBDV的报道，但是，没能得到应用。根据研究鸡传染性法氏囊病高效灭活疫苗的需要，本研究采用鸡胚源DF-1细胞系，通过生物反应器中微载体悬浮培养，获得比传统培养方法提高100倍的高效价病毒抗原，并用其成功研制了一种优质、高效的法氏囊灭活疫苗，以满足市场的需要。研究结果如下：1根据高效培养IBDV对于病毒滴度检测的需要，针对鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物，以所构建的重组质粒作为阳性标准品，成功建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量RT-PCR（QRT-PCR）方法。应用该方法和经典TCID50方法初步对IBDV在方瓶中增殖动态的测定结果表明，两种方法测定的方瓶DF-1细胞中IBDV的增殖曲线具有一定的平行关系，但QRT-PCR方法（4h）比TCID50方法（3-4d）更快速和敏感。2应用所建立的QRT-PCR方法首次对微载体转管微型反应器和AP10生物反应器培养的DF-1细胞中IBDV的增殖特性进行了较为系统的研究，并与经典的TCID50测定法进行了比较。结果表明：①转管（内置0.6g纸片载体）中接种3×107个DF-1细胞，培养144h细胞可增至最大值2.4～2.5×108个，为最佳接毒时间；最佳接毒剂量为0.79MOI，最佳收毒时间为接毒后的28h；上清和全悬液毒价呈平行关系，但后者更高，可达9.5（-lgTCID50/mL）以上（为转瓶毒价的10倍）。②转管中细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系，在细胞生长期内（144h）平均每个细胞耗糖量为6.5×10-10g/24h，可根据糖耗量推测细胞生长状态和数量；接毒后糖耗速率的高峰要先于病毒滴度的高峰，在糖耗高峰出现后下降至趋于零的瞬间收获，可获得较高毒价的病毒液。③在转管培养毒价高峰时收获1/3毒液后9h，收获1/2毒液后18h可再次获得最高毒价的毒液；④反应器中接毒剂量为1.05MOI时，接毒后24h最高毒价达到9.5（-lgTCID50/mL）；1/2换液后8h最高毒价只达到9.25（-lgTCID50/mL）。⑤反应器中糖耗高峰比毒价高峰早，在耗糖量下降为0的左右病毒毒价达到高峰，但是毒价高峰与接毒时的细胞数和接毒剂量有关。⑥荧光定量测定的高密度培养条件下IBDV毒价的上升和下降趋势及高峰的时间与TCID50测定结果基本一致，但荧光定量方法更快速和敏感。3用IBDV细胞毒HQ株在鸡胚源DF-1细胞系上连续传10代，并对10代内的细胞毒液分别进行了病毒含量测定及免疫原性、特异性、保存期和纯净性的鉴定，证明在10代内HQ株细胞毒的上述特性基本一致，从而建立了IBDV HQ株的生产种子批。将IBDV HQ株反应器DF-1细胞培养液（109.5TCID50/mL）、转瓶DF-1（108.5TCID50/mL，3倍浓缩）及CEF细胞培养液（107.5TCID50/mL，5倍浓缩）按试行规程制备灭活疫苗，并进行各项检验。结果表明，其半成品及成品检验（物理性状检验、无菌检验、安全试验）均符合规程要求。三种疫苗免疫原性检验结果显示，DF-1细胞反应器疫苗中和抗体明显高于转瓶苗，攻毒保护免疫组两种DF-1疫苗都为100℅保护，对照组保护率为0，CEF苗中和抗和攻毒保护都较DF-1苗低。本研究通过利用转管载体微型反应器进行DF-1细胞高密度培养，在自动控制的生物反应器中进行IBDV最佳培养条件和收毒方式的探索，从而为工厂化大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗提供理论依据和实践经验，因而具有很大的实用性。
甘军纪[10]（2010）在《表达鸡新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的临床前研究》文中指出鸡新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的家禽最严重的传染病之一。NDV的病毒囊膜含有2个主要的糖蛋白,即融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）,它们都被用于重组鸡痘病毒疫苗的研究。本研究从我们实验室已构建的单表达、共表达新城疫病毒（NDV）融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）基因的重组鸡痘病毒中筛选一个作为疫苗候选株,进一步完善实验室试验,并在GMP条件下完成中间试制,为新城疫重组鸡痘病毒活疫苗顺利进入临床试验打好了基础。1.单表达和共表达NDV F和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验为评价母源抗体对抗新城疫（ND）重组鸡痘病毒（rFPV）活疫苗免疫效力的影响,本研究用单表达、共表达NDV基因Ⅶ型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12LSF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳剂灭活疫苗分别免疫14日龄商品蛋鸡,重组鸡痘病毒疫苗的免疫剂量均为2×104PFU,免疫后21d分别用106ELD50NDV不同强毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保护率分别为30.3%、73.2%、41.1%、89.3%；而ZJ1株攻毒的免疫保护率分别为35.8%、67.9%、78.6%、100%。用表达鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒rFPV-12LSIL-2与rFPV-12LSHN联合免疫没有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保护力。试验结果表明,单表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒rFPV-12LSHN可作为ND活疫苗候选株,为ND重组鸡痘病毒活疫苗的进一步应用性开发奠定了基础。2.表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究为了评价转基因对鸡痘病毒（FPV）生物学特性的影响,通过电镜观察重组鸡痘病毒（rFPV）感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）,结果表明在FPV中插入NDV血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）基因（rFPV-12LSHN）后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程。rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无显着差异。rFPV-12LSHN接种11日龄鸡胚,在尿囊膜（CAM）上观察到典型痘斑或水肿,鸡胚最小感染量≤100PFU。免疫荧光试验证明,rFPV-12LSHN在CEF上传代能稳定表达NDV HN抗原。rFPV （103PFU/羽）接种SPF鸡快速诱导NDV HI抗体应答,免疫3周后完全保护NDV强毒攻击。3.表达新城疫HN基因的重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究为了评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显着提高对NDV的体液免疫应答水平（P<0.01）,对NDV强毒攻击的保护率没有影响。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN勺二次免疫可以提高疫苗的免疫力。4.重组鸡痘病毒活疫苗X-gal染色空斑计数法的建立建立了一种简易的携带LacZ基因重组鸡痘病毒（rFPV）活疫苗的X-gal染色空斑计数法。rFPV接种次代鸡胚成纤维细胞（CEF）72h后,加2mL/L戊二醛固定液室温固定15min,再加500ug/mL X-gal染色液37℃过夜,倒置显微镜下直接计数蓝染空斑。染色空斑计数法的空斑数是不染色直接计数法的1.6-3.3倍。该方法在重组鸡痘病毒活疫苗研究及其工业化生产检验中具有较大的应用价值。5.鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的中试生产为了给临床试验提供疫苗,在GMP条件下进行了鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗（rFPV-ND-HN）的中试生产。CEF作为制苗材料,培养于10000ml转瓶,按0.2PFU/细胞接种毒种rFPV-12LSHN,37℃12转/h旋转培养,待细胞病变达到80%,收获感染细胞,加适量的5%蔗糖-脱脂奶粉,随后冻干。共生产了5批rFPV-ND-HN冻干疫苗,质量指标全部达到标准要求。总结1.筛选出单表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）作为疫苗候选株。2. rFPV-12LSHN与亲本毒株FPV-LP在CEF细胞内的病毒形态、繁殖方式以及病毒产量没有明显变化。3. rFPV-12LSHN活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周。4. rFPV-12LSHN勺二次免疫可以显着提高疫苗的NDV HI抗体应答。5.建立了一种简易、快速、敏感的重组鸡痘病毒活疫苗的X-gal染色空斑计数方法。6.在GMP条件下中试生产了5批rFPV-ND-HN疫苗。
二、冻干种毒在制备鸡传染性喉气管炎和鸡痘活疫苗生产中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、冻干种毒在制备鸡传染性喉气管炎和鸡痘活疫苗生产中的应用（论文提纲范文）
（1）禽类弱毒疫苗外源因子污染检测方法的研究进展（论文提纲范文）
| 1 禽用弱毒疫苗污染EA的原因 |
| 2 EA检测方法 |
| 2.1 传统检测方法 |
| 2.2 免疫学检测技术 |
| 2.3 PCR技术 |
| 2.3.1 常规PCR |
| 2.3.2 实时荧光定量PCR(RT-q PCR) |
| 2.3.3 液滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR) |
| 2.4 基因芯片技术 |
| 2.5 高通量测序 |
| 3 不同检测方法的比较 |
| 4 总结与展望 |
（2）鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 H9亚型禽流感病毒遗传进化与疫苗研究进展 |
| 1 禽流感病毒的基因组特征 |
| 2 H9亚型AIV的基因演化与变异 |
| 3 H9亚型AIV疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 文献综述 以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体的重组疫苗研究进展 |
| 1 HVT的特点 |
| 2 HVT的基因结构 |
| 3 HVT载体构建的方法 |
| 4 HVT作为载体的应用 |
| 5 重组HVT疫苗存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组火鸡疱疹病毒构建和安全性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 重组病毒的免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组病毒rHVT-YBF003培养工艺研究与种子批建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1.1 IBV的病原学特征 |
| 1.1.1 IBV的历史 |
| 1.1.2 IBV的分类 |
| 1.1.3 IBV的形态 |
| 1.1.4 IBV的理化特征 |
| 1.1.5 IBV的培养特性 |
| 1.1.6 IBV的致病性 |
| 1.2 IBV分子生物学特性 |
| 1.2.1 IBV的基因组 |
| 1.2.2 IBV的主要编码蛋白 |
| 1.2.3 IBV毒株分类 |
| 1.3 IB发病机理 |
| 1.3.1 宿主易感性 |
| 1.3.2 年龄和品种倾向 |
| 1.3.3 受体和进入 |
| 1.3.4 感染和传播 |
| 1.3.5 潜伏期 |
| 1.3.6 临床病程和临床表现 |
| 1.3.7 剖检及组织病理学 |
| 1.3.8 病理变化 |
| 1.3.9 发病率和死亡率 |
| 1.4 IBV变异机制 |
| 1.4.1 点突变 |
| 1.4.2 基因缺失或插入 |
| 1.4.3 同源重组 |
| 第二章 IBV诊断技术概况 |
| 2.1 临床诊断 |
| 2.2 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.1 鸡胚培养 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 器官培养 |
| 2.3 电镜检查 |
| 2.4 免疫组织化学法 |
| 2.5 血清学诊断方法 |
| 2.6 分子生物学诊断方法 |
| 2.6.1 RT-PCR |
| 2.6.2 RFLP |
| 2.6.3 荧光定量RT-PCR |
| 2.6.4 序列分析 |
| 第三章 IB疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 山东地区IBV分离鉴定及遗传变异分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 病料来源 |
| 1.1.2 菌(毒)株、血清、试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.4 病毒分离 |
| 1.1.5 分离毒株生物学特性鉴定 |
| 1.1.6 分离毒株毒价(EID50)测定 |
| 1.1.7 分离毒株的致病性试验 |
| 1.1.8 遗传变异分析 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 病毒分离结果 |
| 1.2.2 分离毒株生物学特性鉴定结果 |
| 1.2.3 分离毒株毒价(EID50)测定结果 |
| 1.2.4 分离毒株的致病性试验结果 |
| 1.2.5 分离毒株S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 1.2.6 克隆质粒的鉴定结果 |
| 1.2.7 S1基因遗传变异分析结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 IBV鸡胚分离的准确性 |
| 1.3.2 山东地区IBV遗传变异分析及疫苗研发方向 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 IBVReal-timePCR检测试剂盒的研究与应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌毒株与试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、试剂盒及仪器设备 |
| 2.1.3 引物设计与合成 |
| 2.1.4 病毒RNA的提取和cDNA合成 |
| 2.1.5 E基因的扩增及质粒标准品的制备 |
| 2.1.6 RealtimeRT-PCR方法的建立 |
| 2.1.7 试剂盒的组装及保存期试验 |
| 2.1.8 临床应用 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 E基因的扩增及质粒标准品的制备结果 |
| 2.2.2 RealtimeRT-PCR方法的建立 |
| 2.2.3 敏感性试验结果 |
| 2.2.4 特异性试验结果 |
| 2.2.5 重复性试验结果 |
| 2.2.6 试剂盒的组装及保存期试验 |
| 2.2.7 临床应用结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 荧光定量PCR引物的设计 |
| 2.3.2 荧光定量PCR的优点与先进性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 IBV间接ELISA抗体检测试剂盒研究与应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生物性材料 |
| 3.1.2 所需试剂 |
| 3.1.3 设计引物 |
| 3.1.4 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.1.5 pET30a-S1诱导表达与可溶性鉴定 |
| 3.1.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.7 重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.1.8 ELISA反应条件的优化 |
| 3.1.9 间接ELISA判断标准的确定 |
| 3.1.10 特异性试验 |
| 3.1.11 敏感性试验 |
| 3.1.12 重复性试验 |
| 3.1.13 符合率试验 |
| 3.1.14 试剂盒的组装及保存期试验 |
| 3.1.15 试剂盒的临床应用 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RT-PCR扩增与表达质粒的鉴定 |
| 3.2.2 表达质粒的鉴定结果 |
| 3.2.3 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.4 重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.2.5 ELISA最佳反应条件的确定 |
| 3.2.6 ELISA判定标准的确定 |
| 3.2.7 特异性试验结果 |
| 3.2.8 敏感性试验结果 |
| 3.2.9 重复性试验结果 |
| 3.2.10 符合率试验结果 |
| 3.2.11 试剂盒的组装 |
| 3.1.12 试剂盒的保存期试验结果 |
| 3.2.13 临床应用结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 ELISA方法检测IBV抗体的优势 |
| 3.3.2 间接ELISA包被抗原的选择 |
| 3.3.3 间接ELISA判定标准的选择 |
| 3.3.4 间接ELISA应用前景 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 IBV病毒增殖优化研究与生产应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株、细胞 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 IBV不同毒株增殖培养最适细胞系的确定 |
| 4.1.4 应用细胞增殖培养IBV毒株培养条件的优化 |
| 4.1.5 应用小型生物反应器增殖培养IBV毒株 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 IBV不同毒株增殖培养最适细胞系的确定 |
| 4.2.2 应用Vero细胞增殖培养IBV培养条件的优化 |
| 4.2.3 应用小型生物反应器增殖培养GQ/2015株与491株 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 细胞系的选择 |
| 4.3.2 病毒增殖条件的优化 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 IBVGQ/2015株灭活疫苗的研制与免疫效果研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒株、细胞 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 IBVGQ/2015株基础种子标准的优化与制定 |
| 5.1.4 IBVGQ/2015株生产种子标准的优化与制定 |
| 5.1.5 IBVGQ/2015株制苗用毒液的制备 |
| 5.1.6 半成品检验 |
| 5.1.7 油乳剂灭活疫苗制备 |
| 5.1.8 成品检验 |
| 5.1.9 灭活疫苗的免疫效果试验 |
| 5.1.10 灭活疫苗的保存期试验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 IBVGQ/2015株基础种子标准的制定 |
| 5.2.2 IBVGQ/2015株生产种子标准的制定 |
| 5.2.3 半成品检验结果 |
| 5.2.4 成品检验结果 |
| 5.2.5 灭活疫苗的免疫效果试验结果 |
| 5.2.6 灭活疫苗的保存期试验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 IB疫苗毒株的选择 |
| 5.3.2 IB疫苗毒株的细胞培养优点及疫苗效力评价 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）禽白血病标准抗原、标准抗体候选物的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 研究一 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的制备 |
| 2.2 禽白血病标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的标定 |
| 2.3 标准抗原候选物在检验商品试剂盒中的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的制备 |
| 3.2 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的标定 |
| 3.3 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物检验商品化试剂盒的结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 研究二 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病群特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病标准血清候选物的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的制备 |
| 2.2 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的标定 |
| 2.3 禽白血病群特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物在检验商品试剂盒中的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的制备 |
| 3.2 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的标定 |
| 3.3 禽白血病群特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物检验商品试剂盒的结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）一株天鹅源小鹅瘟病毒的全基因序列分析及小鹅瘟病毒标准抗原抗体物质的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号缩写 |
| 文献综述 |
| 1. 概述 |
| 2. 小鹅瘟病毒的概况 |
| 2.1 小鹅瘟病毒的分类地位 |
| 2.2 病毒的形态和理化特性 |
| 2.3 病毒的基因组结构 |
| 2.4 基因组编码的蛋白及其功能 |
| 3. 小鹅瘟病的概况 |
| 3.1 流行病学 |
| 3.2 临床症状 |
| 3.3 病理变化 |
| 4. 小鹅瘟的实验室诊断 |
| 4.1 病毒的分离培养 |
| 4.2 分子生物学方法 |
| 4.3 血清学诊断方法 |
| 5. 小鹅瘟的防治 |
| 6. 标准物质的研究进展 |
| 6.1 标准物质的含义及作用 |
| 6.2 标准物质的发展历程 |
| 6.3 标准物质的制备要求 |
| 6.4 标准物质的发展展望 |
| 参考文献 |
| 研究内容一 一株天鹅源小鹅瘟病毒的全基因序列分析 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 生物材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血凝试验 |
| 2.3 DNA的提取 |
| 2.4 PCR鉴定 |
| 2.5 全基因组的测定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 分离病毒无血球凝集作用 |
| 3.3 PCR鉴定结果 |
| 3.4 分离株GPV-XZ20150328株全基因片段PCR扩增结果 |
| 3.5 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.6 GPV全基因序列分析 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究内容二 小鹅瘟病毒抗原标准物质的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器及耗材 |
| 1.3 试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 病毒特性分析 |
| 2.3 小鹅瘟病毒标准抗原物质的制备及其他检验 |
| 2.4 小鹅瘟病毒标准抗原的初步应用 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒纯化效果的鉴定 |
| 3.2 病毒纯异性分析结果 |
| 3.3 病毒灭活条件选择结果 |
| 3.4 两种方法制备的琼扩抗原效价比较结果 |
| 3.5 小鹅瘟病毒标准抗原物质的其他检验结果 |
| 3.6 小鹅瘟病毒标准抗原的初步应用结果 |
| 4. 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 研究内容三 小鹅瘟病毒抗体标准物质的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 小鹅瘟病毒标准抗体物质的制备 |
| 2.2 小鹅瘟病毒多抗血清的特性分析 |
| 2.3 小鹅瘟病毒单抗的特性分析 |
| 2.4 小鹅瘟病毒标准抗体物质的其他检验 |
| 2.5 小鹅瘟病毒标准抗体的初步应用 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鹅瘟病毒抗体物质的制备结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒多抗血清的特性分析结果 |
| 3.3 小鹅瘟病毒单抗的特性分析结果 |
| 3.4 小鹅瘟病毒标准抗体物质的其他检验结果 |
| 3.5 小鹅瘟病毒标准抗体的初步应用结果 |
| 4. 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 禽白血病概况 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床特征和病理变化 |
| 1.4 禽白血病的检测和诊断 |
| 1.5 预防和控制 |
| 2. 病毒的准种及其演变 |
| 2.1 准种的特性 |
| 2.2 准种的作用 |
| 2.3 准种的研究方法 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 禽白血病病毒P27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒的双酶切鉴定 |
| 2.4 P27蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.5 表达蛋白的纯化 |
| 2.6 表达蛋白的WESTERN-BLOTTING鉴定 |
| 2.7 兔抗P27蛋白抗体的效价测定 |
| 2.8 兔抗P27蛋白抗体的纯化 |
| 2.9 兔抗P27抗体的酶标化结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 禽白血病病毒抗原ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 双抗体夹心ELISA相关试验条件的确定 |
| 2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3 特异性试验 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 符合率试验 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.8 临床试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 间接ELISA相关试验条件的确定 |
| 2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3 特异性试验结果 |
| 2.4 敏感性试验结果 |
| 2.5 重复性试验结果 |
| 2.6 符合率试验结果 |
| 2.7 保存期实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 禽弱毒疫苗中ALV的分离鉴定及其全基因组序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三种活疫苗中ALV的分离鉴定 |
| 2.2 三株ALV全基因组的克隆测序 |
| 2.3 分离毒株GP85基因的序列分析与亚群鉴定 |
| 2.4 分离毒株与不同亚群参考毒株主要基因区域的同源性比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 血管瘤病鸡中AIV-J的分离鉴定及其准种分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 血清抗体检测 |
| 2.3 ALV-J的准种多样性 |
| 2.4 氨基酸序列同源性比较 |
| 2.5 细胞传代前后准种比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 第八章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87）国家参考品的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图及附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病 |
| 1.1.1 鸡传染性法氏囊病背景 |
| 1.1.2 鸡传染性法氏囊病毒病原学 |
| 1.1.3 鸡传染性法氏囊病毒分子病原学 |
| 1.1.4 病毒的繁殖 |
| 1.1.5 免疫抑制 |
| 1.1.6 鸡传染性法氏囊病毒的检测技术 |
| 1.2 参考品概述 |
| 1.2.1 定义 |
| 1.2.2 特点 |
| 1.2.3 分级 |
| 1.2.4 作用 |
| 1.3 生物参考品 |
| 1.3.1 定义 |
| 1.3.2 分级与种类 |
| 1.3.3 国内外现状 |
| 1.3.4 活疫苗标准品(参考品)使用情况统计 |
| 1.3.5 生物参考品的稳定性 |
| 1.3.6 疫苗参考品的定值 |
| 1.4 课题研究的目的和意义 |
| 第二章 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试验用仪器 |
| 2.2.2 试验用试剂 |
| 2.2.3 试验用其他材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 参考品制备与检验 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 参考品候选物的筛选 |
| 2.5.2 参考品制备和成品的检验 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品的制备与检验 |
| 2.6.2 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品稳定性试验 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)细胞间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试验用仪器 |
| 3.2.2 试验用试剂 |
| 3.2.3 试验用其他材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Vero细胞的复苏 |
| 3.3.2 间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 高免血清及二抗适宜稀释浓度的确定 |
| 3.4.2 接毒量的确定 |
| 3.4.3 敏感性试验 |
| 3.4.4 ELD_(50)值与TCID_(50)值的对比 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 高免血清与荧光抗体使用浓度的确定 |
| 3.5.2 传统ELD_(50)与TCID_(50)结果分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)荧光定量RT-PCR方法的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试验用仪器 |
| 4.2.2 试验试剂 |
| 4.2.3 试验用其他材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 引物与探针的设计 |
| 4.3.2 标准质粒的构建 |
| 4.3.3 荧光定量RT-PCR反应条件的建立和优化 |
| 4.3.4 引物特异性试验 |
| 4.3.5 检验灵敏性试验 |
| 4.3.6 稳定性试验 |
| 4.3.7 重复性试验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 标准质粒的构建 |
| 4.4.2 引物退火温度的优化 |
| 4.4.3 引物、探针浓度的优化 |
| 4.4.4 引物特异性试验 |
| 4.4.5 检验灵敏性试验 |
| 4.4.6 稳定性试验 |
| 4.4.7 重复性试验 |
| 4.4.8 不同效力值疫苗检测 |
| 4.4.9 失活疫苗荧光定量检测 |
| 4.4.10 ICC/荧光定量RT-PCR方法检测灭活样品中的IBDV RNA |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品协作标定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 定值方法 |
| 5.3.2 协作单位的确定 |
| 5.3.3 发放协作标定材料 |
| 5.4 协作标定结果分析方法 |
| 5.4.1 鸡胚半数致死量(ELD_(50)试验所有定值数据的格拉布斯(Grubbs)检验 |
| 5.4.2 鸡胚半数致死量(ELD_(50))试验所有定值数据的正态性检验 |
| 5.4.3 鸡胚半数致死量(ELD_(50))试验定值结果的确定及不确定度的评定 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 定值数据的格拉布斯(Grubbs)检验 |
| 5.5.2 定值数据的正态性检验 |
| 5.5.3 定值 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 鸡传染性法氏囊中等毒力活疫前(B87株)国家参考品研究技术路线 |
| 附录二 本实验用到的溶液和培养基 |
| 附录三 鸡传染性法氏囊中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品协作标定方案 |
| 作者简历 |
（9）激流式生物反应器大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 传染性法氏囊病概述 |
| 1.1 传染性法氏囊病的发现 |
| 1.2 传染性法氏囊病的生物学特征 |
| 1.3 传染性法氏囊病流行现状 |
| 2 传染性法氏囊病毒分子生物学研究进展 |
| 3 传染性法氏囊病检测方法的研究进展 |
| 3.1 IBD 常规检测方法及应用 |
| 3.2 IBD 分子生物学检测方法研究进展 |
| 4 动物细胞大规模培养技术的研究进展 |
| 4.1 动物细胞培养及常用的细胞系 |
| 4.2 微载体及其培养技术的发展 |
| 4.3 生物反应器的种类及应用 |
| 4.4 生物反应器微载体大规模培养动物细胞的现状 |
| 4.5 安普激流灌注式生物反应器的应用 |
| 5 传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 5.1 传统疫苗的研究及应用 |
| 5.2 新型疫苗研究进展 |
| 试验一 传染性法氏囊病毒实时 QRT-PCR 检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 细胞系和病毒株 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒 RNA 的提取和 cDNA 的合成 |
| 2.3 标准品的制备 |
| 2.4 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 |
| 2.5 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 的敏感性、特异性及重复性实验 |
| 2.6 实时 QRT-PCR 检测方法对 IBDV 在方瓶 DF-1 细胞中增殖动态的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准质粒 p-18T-493 的构建 |
| 3.2 标准曲线的建立 |
| 3.3 SYBR GreenⅠ荧光定量敏感性实验 |
| 3.4 SYBR GreenⅠ荧光定量特异性实验 |
| 3.5 SYBR GreenⅠ荧光定量重复性实验 |
| 3.6 QRT-PCR 和 TCID50方法对 IBDV 在方瓶中增殖动态的测定 |
| 4 讨论 |
| 实验二、用激流式生物反应器大规模培养传染性法氏囊病毒的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 细胞与病毒种毒 |
| 1.4 实验场地 |
| 2 方法 |
| 2.1 IBDV 在微型反应器（转管纸片载体）DF-1 细胞上培养特性的研究 |
| 2.2 IBDV 在 AP10 激流式生物反应器中 DF-1 细胞上繁殖特性的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 转管中 DF-1 细胞的生长动态和糖耗测定 |
| 3.2 IBDV 在转管 DF-1 细胞中接毒量(MOI)和收毒时间的确定 |
| 3.3 IBDV 在转管(纸片载体)DF-1 细胞中的繁殖动态 |
| 3.4 IBDV 在转管(纸片载体)DF-1 细胞中二次收毒测定 |
| 3.5 激流式生物反应器中 IBDV 增殖动态的测定 |
| 3.6 激流式生物反应器中 IBDV 二次收毒实验 |
| 4 讨论 |
| 试验三 用反应器和转瓶培养 IBDV 制备灭活疫苗的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 细胞与病毒 |
| 1.4 试验用 SPF 鸡 |
| 2 方法 |
| 2.1 IBDV HQ 株在 DF-1 细胞系上种毒库的建立和鉴定 |
| 2.2 IBDCEF 细胞、DF-1 细胞转瓶及反应器 DF-1 细胞灭活疫苗的制备及检验 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBDV HQ 株在 DF-1 细胞系上种毒库的建立和鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒含量的测定 |
| 3.1.2 特异性测定 |
| 3.1.3 纯净度检验 |
| 3.1.4 免疫原性测定 |
| 3.1.5 保存期的测定 |
| 3.2 转瓶 CEF 细胞、DF-1 细胞及反应器 DF-1 细胞 IBD 疫苗的制备和检验 |
| 3.2.1 反应器病毒液的制备 |
| 3.2.2 转瓶 CEF 细胞和 DF-1 细胞 IBD 病毒液的制备及浓缩试验结果 |
| 3.2.3 IBD 三种病毒液的灭活和检验 |
| 3.2.4 IBD 三种疫苗的乳化与分装 |
| 3.2.5 IBD 三种疫苗的检验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（10）表达鸡新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的临床前研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 单表达和共表达NDV F和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒的 #10部分生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 重组鸡痘病毒活疫苗X-GAL染色空斑计数法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的中试生产 |
| 一.材料与方法 |
| 1 毒种与SPF种蛋 |
| 2 生化、化学试剂 |
| 3 疫苗制造及半成品检验 |
| 4 成品检验 |
| 二.结果 |
| 三.小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结和创新点 |
| 综述 重组禽痘病毒活疫苗研究进展 |
| 1 禽痘病毒疫苗株及其分子生物学特点 |
| 2 高效表达的重组禽痘病毒转移载体 |
| 3 表达不同外源基因的重组禽痘病毒 |
| 4 重组禽痘病毒疫苗的免疫 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、冻干种毒在制备鸡传染性喉气管炎和鸡痘活疫苗生产中的应用（论文参考文献）
- [1]禽类弱毒疫苗外源因子污染检测方法的研究进展[J]. 陈秀琴,郑敏,黄梅清,林苏,郑良焰,林锋强. 中国家禽, 2021(08)
- [2]鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用[D]. 董炳梅. 吉林大学, 2019
- [3]表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验[D]. 楚电峰. 扬州大学, 2018(05)
- [4]鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价[D]. 苗立中. 吉林大学, 2018(12)
- [5]禽白血病标准抗原、标准抗体候选物的研制[D]. 纪依依. 扬州大学, 2016(02)
- [6]一株天鹅源小鹅瘟病毒的全基因序列分析及小鹅瘟病毒标准抗原抗体物质的制备[D]. 宋娜. 扬州大学, 2016(02)
- [7]禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析[D]. 毛娅卿. 中国农业大学, 2014(08)
- [8]鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87）国家参考品的研制[D]. 郭彩云. 中国兽医药品监察所, 2012(11)
- [9]激流式生物反应器大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗的研究[D]. 周欣. 河南农业大学, 2012(06)
- [10]表达鸡新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的临床前研究[D]. 甘军纪. 扬州大学, 2010(04)