抗HEVORF2单链可变区抗体的筛选与鉴定

一、抗HEVORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定（论文文献综述）

王思令^[1]（2017）在《抗戊型肝炎病毒人源单克隆抗体筛选平台的建立及初步应用》文中研究指明戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）所引起的病毒性肝炎。HEV是单股正链RNA病毒,基因组全长7.2 kb,包含3个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,其中ORF2负责编码戊型肝炎病毒唯一的衣壳蛋白,共包含660个氨基酸,该蛋白参与了病毒组装、免疫及病毒细胞相互作用。近年来,HEV已逐渐成为全球范围内引发急性病毒性肝炎的最主要原因之一。孕妇与老年人是主要高危人群。戊型肝炎病例的病死率约为0.2～4%,孕妇感染HEV的病死率可高达10～25%。本研究通过对p239类病毒颗粒荧光标记不同方案的比较,最终确定了应用生物素-链亲和素荧光信号放大系统对p239进行标记。此外,将最初的抗原特异性记忆B细胞的染色方案进行了优化,去除了 CD3/CD14/IgM这三个指标。以CD20/CD27/IgG/p239为特异性标志物,筛选一位体内HEV抗体滴度较高的接种过戊型肝炎疫苗的志愿者,分离外周血,得到识别戊型肝炎病毒类病毒颗粒p239的特异性记忆B细胞。通过单细胞RT-PCR技术,获得了 10株人源HEV单克隆抗体。而这10株中的T183具有较高的中和活性。通过检测抗体与E2s突变蛋白的反应性,以及比较抗体阻断不同分区鼠单抗的能力,可以发现人源HEV单抗主要识别C2/C3/C5/C6分区鼠单抗所对应的免疫表位,特别是G591、P592两个氨基酸位点所形成的免疫表位,进一步佐证了前期研究对于这些表位为免疫优势表位的分析。本研究成功建立了 HEV人源抗体筛选平台,该平台应用了流式细胞术、单细胞PCR等技术,能够在最短28天内获得病原体特异的人源单克隆抗体,对于防控新发传染病的爆发流行具有重要意义。随着肿瘤免疫治疗研究的逐渐深入,人源单克隆抗体的应用范围不断拓展,市场需求也逐渐增加,该平台的建立为下一阶段对于肿瘤治疗的研究提供了技术支持。

张建琼,魏华,鲁晓萱,鲍海逊,孟继鸿,谢维^[2]（2004）在《人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定》文中指出目的获得人源中和性抗戊型肝炎病毒（HEV）单克隆基因工程抗体。方法采用五轮筛选法（逐轮降低抗原包被量 ,严格洗脱条件） ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原淘筛本室构建的HEV患者外周血源的噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的噬菌体抗体 ,酶切鉴定抗体基因插入。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因构建表达载体 ,在大肠杆菌中可溶性表达抗HEV抗体Fab段 ,ELISA、Westernblot检测抗体免疫学活性 ;测序分析抗体基因。结果筛选出 4株与含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。切去gⅢ基因 ,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段 ,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中差异无显着性。可溶性抗体与含中和抗原表位的HEVORF2重组混合抗原有特异结合活性 ,与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Westernblot显示在相对分子质量（Mr）略大于 4 5× 10 3 处有一明显条带 ,与Mr4 8× 10 3 的Fab大小一致。DNA测序分析表明 ,Fab段VH 属于IgGVH3基因家族 ,VL 属于Vκ1基因家族。结论利用噬菌体抗体库技术成功获得抗HEV的人源单克隆抗体。

成军,斯崇文^[3]（2002）在《第七次全国感染病学术会议纪要》文中研究指明

倪勤,成军,钟彦伟,王松山,施双双,董菁,夏小兵,张耀新,翟琦^[4]（2000）在《抗HEVORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定》文中认为目的 :筛选和鉴定抗戊型肝炎病毒（HEV）开放读码框架 2 （ORF2 ）的人源化噬菌体单链可变区抗体。方法 :以大肠杆菌表达的重组 HEV ORF2多肽做为固相包被抗原 ,从半合成的人源化噬菌体抗体库中经过 4轮“吸附 -洗脱 -扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（EL ISA ）、DNA序列分析鉴定 ,获得抗原结合活性较强的抗 -HEV ORF2单链可变区抗体 ,并以间接酶标法用该抗体对戊型肝炎患者石蜡包埋肝组织中的 HEV ORF2抗原进行免疫组织化学鉴定。结果 :筛选到的抗 - HEV ORF2的单链可变区抗体基因。酶切和序列分析表明 ,该抗体基因由 795 bp组成 :EL ISA和免疫组织化学结果显示 ,抗 - HEV ORF2人源化噬菌体单链可变区抗体能与重组 HEVORF2抗原特异性结合 ,并能够特异性识别戊型肝炎患者肝组织中的 HEV抗原。结论 :此法筛选的噬菌体单链可变区抗体亲和性较好 ,特异性强 ,较单克隆抗体制备方法简便 ,周期短 ,为进一步研究应用奠定了基础。

倪勤,翟琦,王莉,王松山,张耀新,卢晓梅,张巍^[5]（2000）在《戊型肝炎患者肝组织中HEV抗原的检测研究》文中认为目的 :用抗 - HEV ORF2单克隆抗体和抗 - HEV ORF2单链可变区抗体研究急性戊型肝炎的免疫病理学 ,探讨二者在临床病理诊断中的应用价值。方法 :（1）以杂交瘤技术制备的抗 - HEV单克隆抗体（Mc Ab,m ono-clonal antibody）作为第一抗体 ,用免疫组化 L SAB法检测急性戊型肝炎患者肝组织中的 HEV抗原。（2 ）用抗 - HEVORF2单链可变区抗体以间接酶标法检测肝组织内的 HEV抗原。结果 :用抗 - HEV单克隆抗体从 14例急性戊型肝炎肝标本中检出 9例 HEV抗原阳性者（6 4.2 8% ） ,其中 8例阳性标本用抗 - HEV ORF2单链可变区抗体检测HEVAg均为阳性。HEV抗原在肝细胞浆表达以胞浆弥漫型为主 ,尚可见膜型表达。HEV抗原阳性细胞集中分布在病变明显区 ,伴淋巴细胞浸润 ,病变较轻区也可见随机散在分布 ,部分阳性肝细胞无变性。胆管上皮细胞中见有HEV抗原阳性颗粒。结论 :本研究结果支持急性戊型肝炎的免疫致病机理。 HEV抗原在胆管上皮细胞的检出可能为 HEV从胆管上皮细胞向胆小管排泌提供了一个直观的证据。同时表明两种抗体可作为一种特异而有效的HEV抗原检测试剂。

二、抗HEVORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、抗HEVORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定（论文提纲范文）

（1）抗戊型肝炎病毒人源单克隆抗体筛选平台的建立及初步应用（论文提纲范文）

摘要

Abstract

缩略词

第一章绪论

1. 戊型肝炎病毒

1.1 戊型肝炎概述

1.2 戊型肝炎病毒的结构构成

1.3 戊型肝炎疫苗的研究进展

2. 单克隆抗体研究概述

2.1 抗体的结构与功能

2.2 B细胞的分化和成熟

2.3 单克隆抗体的应用

2.4 单克隆抗体的获取

第二章材料与方法

1. 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要实验耗材

1.3 常用质粒、菌株、细胞

1.3.1 常用质粒

1.3.2 常用菌株

1.3.3 细胞株

1.4 主要试剂

1.4.1 PCR扩增及分子克隆用试剂

1.4.2 细胞培养及转染用试剂

1.4.3 质粒及样品核酸提取试剂

1.4.4 抗原、抗体、酶标记抗体及显色底物

1.4.5 其他常规试剂

1.5 实验用溶液配制

1.5.1 分子生物学实验所用液体配制

1.5.2 包涵体洗涤试剂

1.5.3 PBS(pH 7.45)

1.5.4 磷酸缓冲液(CB,pH9.6)

1.5.5 Western-blotting相关试剂

1.5.6 细胞生物学实验用试剂配制

1.5.7 ELISA液体配制

1.5.8 单抗细胞培养基溶液配制

1.6 分子克隆实验中所涉及使用的引物

1.6.1 定点突变所用引物

1.6.2 Real-time PCR定量检测引物

1.6.3 巢式PCR引物

1.6.4 表达克隆引物

2. 方法

2.1 分子克隆

2.2 单克隆抗体的制备和纯化

2.3 抗原蛋白的表达及生物素标记

2.4 p239特异性记忆B细胞分选

2.5 单细胞RT-PCR

2.6 pMD18-T载体载体构建和测序2.6.1 T载体构建

2.7 表达载体构建

2.8 抗体表达

2.9 抗原特异性检测

2.10 原位酶联免疫吸附实验(抗体中和活性测定)

2.11 酶联免疫吸附实验(抗体交叉阻断、敏感性氨基酸分析)

第三章结果与分析

1. p239的表达与纯化

2. p239的荧光标记

3. HEV特异记忆B细胞染色方案的优化

4. p239抗原加入量摸索

5. 分选HEV特异的记忆B细胞

6. 单细胞PCR

7. 抗体基因分析

8. 表达克隆的构建及抗体表达

8.1 构建抗体表达克隆

8.2 抗体的小量表达鉴定

8.3 抗体的大量表达

9. 抗体反应性检测

10. 抗体中和活性检测

11. 抗体关键识别位点鉴定

12. 人源单克隆抗体阻断鼠源单克隆抗体性质分析

第四章讨论

1. 人源抗体筛选平台的建立及应用

1.1 抗原荧光标记

1.2 记忆B细胞染色方案优化

2. 抗HEV人源单克隆抗体性质分析

第五章小结与展望

1. 小结

2. 展望

参考文献

附录

致谢

（2）人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定（论文提纲范文）

材料和方法

结果

1.噬菌体抗体库的筛选:

2.阳性噬菌体抗体的筛选与鉴定:

3.可溶性Fab的表达与鉴定:

4.免疫印迹实验:

5.抗体可变区DNA序列的测定:

6.竞争ELISA:

讨论

（3）第七次全国感染病学术会议纪要（论文提纲范文）

一、细菌感染性疾病

1.细菌耐药及其分子生物学机制

2. 散发军团菌病

3.感染性心内膜炎

4.107例不明原因发热的回顾性分析

二、病毒感染性疾病

1.肾综合征出血热

2.巨细胞病毒感染

3.获得性免疫缺陷综合征

4.病毒性肝炎

(1) 病毒性肝炎的病原学检测及其耐药与突变

(2) 病毒性肝炎发病的分子生物学机制

(3) 丙型肝炎病毒结构基因的转基因小鼠

(4) 慢性病毒性肝炎的治疗

三、寄生虫

（4）抗HEVORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定（论文提纲范文）

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 特异性

1.3 阳性克隆株DNA序列测定

1.4 间接酶标法免疫组织化学染色

2 结果

2.1 具有免疫亲和活性的噬菌体单链可变区抗体的筛选结果

2.2 阳性克隆株酶切及DNA测序结果

2.3 免疫组织化学鉴定结果

3 讨论

（5）戊型肝炎患者肝组织中HEV抗原的检测研究（论文提纲范文）

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.2 主要免疫试剂

1.3 免疫组织化学染色方法

1.3.1 链霉亲和素-生物素标记法 (LSAB法)

1.3.2 间接酶标法免疫组织化学染色

1.3.3 对照设置