一、Identification of a New Member of the Ep-CAM (17-1A) Tumor-Associated Antigen Family（论文文献综述）
潘好奇[1]（2021）在《ILK影响食管鳞癌细胞对铂类化疗药物敏感性的研究》文中研究表明目的:通过细胞水平研究整合素连接激酶（Integrin-linked kinase,ILK）对食管鳞癌细胞顺铂化疗敏感性的影响,为食管癌的精准治疗提供理论基础和新的策略。方法:1.通过分析The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库ILK在食管鳞癌组织及正常食管组织中的表达情况,并将ILK在食管鳞癌组织中分为高表达组和低表达组,比较两组间的生存期差异。2.以转染建立的ILK过表达或干扰表达且筛选出阳性的食管鳞癌细胞株,采用CCK8实验方法评估ILK表达水平对食管鳞癌细胞顺铂化疗敏感性的影响。结果:1.TCGA数据库中184例食管鳞状细胞癌患者癌组织中的ILK表达明显高于11例正常食管组织中的ILK表达（p<0.05）,差异有统计学意义;食管鳞状细胞癌患者ILK高表达的生存期较低表达患者缩短（p>0.05）,但差异无统计学意义。2.在不同顺铂浓度条件下,ILK过表达组较对照组抑制率均降低。ILK过表达组IC50值（16.78±0.41）明显高于对照组IC50值（8.33±0.37）（p<0.05）;3.在不同顺铂浓度条件下,ILK干扰表达组较对照组抑制率均升高。ILK干扰表达组IC50值（3.72±0.52）明显低于对照组IC50值（8.74±0.46）（p<0.05）。结论:ILK在食管鳞癌中高表达;细胞学实验水平证实ILK过表达可降低食管鳞状细胞癌对顺铂化疗药物的敏感性;而ILK干扰表达可增加食管鳞状细胞癌对顺铂化疗药物的敏感性。
尹良伟[2]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中认为自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
柳颖[3]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究说明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
高育源[4]（2020）在《基于TCGA数据库人脑胶质瘤的生物信息学分析以及KNL1在人脑胶质瘤中的表达情况及其临床意义》文中研究表明背景脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,约占全部颅内肿瘤的60%,发病率高,预后极差,患者中位生存期仅15个月左右。WHO按良恶性程度将脑胶质瘤分为Ⅰ-Ⅳ级,其中Ⅲ级、Ⅳ级为恶性胶质瘤,约占所有脑胶质瘤的78%。目前,临床上治疗胶质瘤主要采用手术切除+术后放化疗,但治疗效果仍不理想,严重影响患者的生活质量,故国内外学者对此进行了深入的研究,研究结果发现:脑胶质瘤与脑内基因改变密切相关,涉及多基因参与的多阶段、多步骤过程,然而其具体机制仍未被阐明。目前已有研究发现动线粒支架1（kinetochore scaffold 1,KNL1）表达与原发性肺癌、直肠癌、乳腺癌等多种癌症发生,及其病理分化程度、增殖、凋亡、预后存在相关性。因此KNL1可能作为潜在的肿瘤治疗靶点,为治疗肿瘤提供新理论依据,然而KNL1能否在胶质瘤中发挥作用仍不清楚。目的明确KNL1在脑胶质瘤中的表达情况及其分子机制,探索KNL1作为胶质瘤潜在的治疗靶点的可能性,及其临床应用价值,为治疗胶质瘤提供新理论依据。方法首先建立数据集,利用TCGA数据库及GEPIA中脑胶质瘤与正常对照组样本的RNA-seq数据及生存数据,分析KNL1在不同胶质瘤分期中的表达及其与预后的关系;筛选出与KNL1共表达的基因,并分析其在胶质瘤与正常对照组间的差异表达;富集分析其功能。然后一方面利用CGGA数据库进行数据验证分析,另一方面利用临床标本进行数据集的验证,收集2015年1月至2017年1月于郑州大学第一附属医院神经外科的脑胶质瘤样本120例及脑外伤切除的脑组织样本20例。采用免疫组织化学法（IHC）检测脑胶质瘤组织中及正常脑组织样本中KNL1的表达情况。分析KNL1表达与患者临床病理学参数的相关性。用Kaplan-Meier生存分析KNL1表达与胶质瘤患者总体生存期（OS）和疾病无进展生存期（PFS）的关系,并通过Cox回归分析影响脑胶质瘤患者OS和PFS的独立因素。结果1.TCGA数据结果显示:KNL1表达量与胶质瘤的不同分期存在差异,即KNL1的表达量在Grade Ⅱ与Grade Ⅲ,Grade Ⅲ与Grade Ⅳ,和Grade Ⅱ与Grade Ⅳ两两比较中都具有显着差异（P<0.05）2.KNL1基因相关生存分析结果显示:KNL1高表达与低表达在总生存期中具有显着性差异,高表达组与较差的预后相关（P<0.05）。3.基因调控网络分析结果显示:有50个与KNL1家族相关调控密切关系的基因,包含三种作用关系（INS,CREB1,PITX2等基因可以调控KNL1基因的表达;CDK1,CDC42,CCNB1可以调控KNL1的状态变更;AURKB可以调控KNL1磷酸化）。4.调控网络内基因共表达分析结果显示:与KNL1共表达的基因有18个（ZWINT,PLK1,NDC80,MAD2L1,KNTC1,KIF2C,ESPL1,CENPF,CENPE,CENPA,CDK1,CDC20,CCNB2,CCNB1,BUB1B,BUB1,BIRC5,AURK8）,且均与KNL1的表达呈正相关性（P<0.05）。5.共表达差异基因差异分析结果显示:KNL1共表达的基因分别在GBM组与对照组和LGG组与对照组之间的表达量进行T检验比较,两组比较中有17个基因（KNL1,ZWINT,PLK1,NDC80,MAD2L1,KIF2C,ESPL1,CENPF,CENPA,CDK1,CDC20,CCNB2,CCNB1,BUB1B,BUB1,BIRC5,AURK8）在至少一组比较中有显着性差异（P<0.05）,其中KNL1在GBM组中差异表达（P<0.05）,并未在LGG组中差异表达（P>0.05）。6.富集分析结果显示:根据与KNL1相关的差异基因,找到潜在的参与脑胶质瘤疾病发展的信号通路（GO BP）,包括:Chromosome segregation、Mitotic sister chromatic segregation等。7.CGGA验证分析结果显示:KNL1表达在CGGA数据库中的不同分级的胶质瘤样本中存在差异表达（P<0.05）,与生信分析结果具有一致性。8.免疫组织化学染色结果显示:与对照组相比,KNL1在胶质瘤中阳性表达高,差异具有统计学意义（P<0.05）。Ⅲ级胶质瘤、Ⅳ级胶质瘤中KNL1阳性表达分别高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。9.KNL1表达与胶质瘤患者临床病理资料的分析结果显示:在胶质瘤中,KNL1阳性表达的与阴性表达在年龄（≤50岁和>50岁）、病理级别（Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级）、KPS评分（≥70分和<70分）中比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。Spearmen等级分析显示KNL1阳性表达与Ki-67高表达具有正相关性（P<0.05）。10.KNL1的表达与胶质瘤患者预后关系分析结果显示:由Kamplan-Meier生存分析,与KNL1阴性表达的患者相比,KNL1阳性表达的患者的PFS和OS更短,差异具有统计学意义（P<0.05）。11.影响胶质瘤患者PFS及OS的COX回归分析结果显示:KNL1表达、KPS评分、WHO分级是影响脑胶质OS和PFS的独立预后因素（P<0.05）。结论1.胶质瘤患者KNL1表达量增加,与肿瘤恶性程度及预后差相关,可作为判断临床预后的指标。2.胶质瘤中KNL1与其共表达基因的异常表达可能通过染色体分离及细胞周期等功能在胶质瘤发病机制中发挥作用。
高新萍[5]（2020）在《MAGE-A3基因对宫颈癌增殖侵袭迁移的影响及机制的研究》文中指出研究背景和目的子宫颈癌的病因虽然绝大部分为高危型HPV感染,但并不是所有感染者均会发生癌变,其发生及发展的机制尚不清楚;目前晚期宫颈癌的中位总生存期仅为16.8个月,所有发展阶段的5年总生存率为68%。其侵袭、转移与不良预后密切相关,是导致患者死亡的主要原因。降低宫颈癌的发病率和病死率,一直是各国医疗卫生领域学者的工作重点。因此在临床中应积极寻找宫颈癌的肿瘤特异性抗原及相关性抗原,对于了解宫颈癌的发生、发展及预测预后等具有十分重要的意义,也为寻找晚期宫颈癌的个体化治疗和生物靶向治疗奠定基础。我们在前期研究中,通过搜索基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）,筛选出宫颈癌发病相关差异基因;并经查阅文献发现在宫颈癌高表达的基因中,黑色素瘤相关抗原A3（melanoma-associated antigen,MAGE-A3）基因在除胎盘和睾丸外的其他正常组织中不表达,但在多种恶性肿瘤中高表达,具有肿瘤特异性。为了验证我们的推测,本研究通过检索癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库和组织基因组表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx）数据库,预测MAGE-A3基因与宫颈癌预后的关系;为了研究MAGE-A3基因与宫颈癌发生发展的关系,我们在宫颈鳞状上皮内病变组织、宫颈癌组织、正常宫颈组织中检测MAGE-A3的表达量。并检测MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达。然后采用过表达质粒转染宫颈癌细胞构建MAGE-A3过表达细胞系,通过siRNA转染构建宫颈癌细胞构建MAGE-A3沉默细胞系,进行一系列细胞功能实验观察MAGE-A3的表达水平是否对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭产生影响。此外,我们进一步探讨了 MAGE-A3影响宫颈癌发病的可能作用机制,并通过构建免疫缺陷小鼠成瘤实验进行体内动物实验对体外细胞学实验的结果进行验证。方法:第一章:利用检索在线TCGA和GTEx数据库,预测MAGE-A3的表达水平对宫颈癌患者预后的影响;选取了宫颈鳞状上皮内病变组织（CINⅢ）40例、宫颈癌组织90例、正常宫颈组织40例,通过免疫组化、PCR、Western blot方法检测MAGE-A3的表达,并分析其与临床病理特征及与预后的关系;第二章:选择人宫颈上皮永生化细胞系End/E6E7以及宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A作为研究对象,通过qRT-PCR及Western blot检测MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达情况。第三章:采用pcDNA3.1-MAGE-A3转染宫颈癌细胞构建MAGE-A3过表达细胞系,通过si-MAGE-A3转染构建宫颈癌细胞构建MAGE-A3沉默细胞系,并通过qRT-PCR及Western blot鉴定转染效果;通过CCK8实验、平板克隆实验,观察MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、Transwell实验,观察MAGE-A3对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响。第四章:分别在MAGE-A3过表达和沉默细胞株中,通过qRT-PCR和We stern blot检测MAGE-A3对宫颈癌细胞中EMT标志物的影响;分别在MAGE-A3过表达和沉默细胞株中,检测Wnt通路相关蛋白的表达变化。第五章:分别将HeLa细胞和SiHa细胞及转染后两种细胞移植于裸鼠皮下,注射后每7d测量1次肿瘤体积,注射28d后从裸鼠体内分离出肿瘤,观察肿瘤体积情况;免疫组化检测各组移植瘤中EMT标记物的表达情况。结果:第一章:与正常宫颈组织及宫颈鳞状上皮内病变组织（CINIII）比较,MA GE-A3在宫颈癌组织中高表达;MAGE-A3在高表达组的总体生存率低于低表达组,并与临床分期,分级及淋巴结转移和HPV感染相关,差异均显着（p<0.01）。第二章:与Endl/E6E7相比,MAGE-A3在宫颈癌细胞中呈现高表达,差异具有统计学意义（p<0.05）,且MAGE-A3在Hela中表达最高,在Siha中表达最低。第三章:pcDNA3.1-MAGE-A3转染Siha细胞后显着上调了细胞中MAGE-A3的表达;si-MAGE-A3转染Hela细胞后有效沉默了细胞中MAGE-A3的表达。CCK8测定结果显示,与si-con组相比,si-MAGE-A3转染后48h、72h和96h的HeLa细胞OD值明显降低。si-MAGE-A3组的克隆数量也少于si-con组。过表达的MAGE-A3 SiHa细胞的OD值较对照组明显升高。与对照组相比,MAG E-A3在SiHa细胞中过表达显着增加了克隆数量。第四章:在HeLa细胞中下调MAGE-A3后,N-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平下降,E-cadherin显着增加;在SiHa细胞中上调MAGE-A3后,N-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平增加,E-cadherin蛋白水平显着降低。M AGE-A3的下调显着降低Hela细胞中β-catein、C-Myc和CyclinD1的表达。MA GE-A3的过表达明显增加Siha细胞中β-catein、C-Myc和CyclinD1的水平。第五章:si-con组的裸鼠肿瘤明显大于si-MAGE-A3组,且增长速度较其快;注射SiHa细胞MAGE-A3组的裸鼠肿瘤大于Vector组,且增长速度也较其快,差异有统计学意义（p<0.05）。在沉默MAGE-A3组的肿瘤组织中,E-cadheri n表达增加,Vimentin蛋白质表达下降;在过表达MAGE-A3组的组织中,E-ca dherin蛋白表达下调,Vimentin蛋白表达上调。结论:MAGE-A3基因参与了宫颈癌的发生发展过程,在宫颈癌组织和细胞中高表达,与患者的总生存期呈负相关,说明MAGE-A3的表达可提示患者的预后;该基因促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并可能通过激活Wnt信号通路促进EMT并影响宫颈癌细胞的生物学行为;其在体内可能通过EMT调控宫颈癌肿瘤的增长。MAGE-A3基因在宫颈癌细胞中上调,并可能调控Wnt信号通路和EMT的过程。MAGE-A3在宫颈癌中的过表达可能参与了宫颈癌的进程,对于进一步了解宫颈癌生物学行为及判断预后有很重要的临床应用价值。
王媛[6]（2020）在《肿瘤蛋白SND1通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递作用促进肿瘤免疫逃逸》文中进行了进一步梳理目的:肿瘤细胞可以通过失去抗原性和/或免疫原性,或者通过诱导肿瘤抑制性免疫微环境而发生免疫逃逸现象。不同的肿瘤免疫逃逸机制决定了临床上不同的免疫治疗方案,因此探讨肿瘤免疫逃逸的分子机制对肿瘤免疫治疗的相关策略有着很重要的指导作用。在肿瘤的免疫逃逸过程中,T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。在20-60%的常见实体癌中,如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等,肿瘤细胞的MHC-I类分子发生表达下调或缺失,这种改变无法诱导CD8+T淋巴细胞（CTL）识别和杀伤肿瘤细胞,是导致肿瘤免疫逃逸最重要的原因之一。MHC-I类分子的调控机制因肿瘤类型而异,这些改变可以是遗传或非遗传的,迄今研究认为,肿瘤细胞MHC-I类分子的调控主要分为表观遗传学调控,转录水平的调控或转录后水平的调控。SND1（Staphylococcal Nuclease And Tudor Domain Containing 1）蛋白是一种新定义的肿瘤蛋白,在几乎所有不同的肿瘤细胞中均高表达。同时,SND1也是一种在真核生物中广泛表达且高度保守的多功能蛋白,在多种细胞生理过程中起着重要的作用。目前的研究表明,SND1可以在细胞水平通过调节不同的信号通路促进肿瘤的发生和转移,然而,SND1对体内肿瘤发生和免疫微环境的影响尚无报道。因此本课题旨在深入探讨SND1与肿瘤免疫逃逸的相关性,以及SND1调控MHC-I类分子抗原呈递的分子机制。方法:本课题主要分为三部分:第一部分:（1）通过免疫亲和纯化实验与质谱分析发现SND1可以与MHC-I类分子的重链HLA-A结合;（2）通过免疫共沉淀、免疫荧光实验及Duolink邻位连接技术验证SND1在体内与HLA-A蛋白的结合,并判断二者相互作用的细胞定位。（3）通过体外纯化蛋白联合GST-Pulldown系统检测SND1蛋白与HLA-A蛋白相互结合的具体结构域,并通过晶体结构预测网站分析模拟二者结合的稳定构象;（4）通过利用含不同信号肽的内质网报告质粒（含绿色荧光蛋白）及免疫荧光实验分析SND1的N端序列对其在内质网定位的重要性。第二部分:（1）利用蛋白质印迹技术（Western Blot）及流式细胞术（Flow cytometry）来检测改变SND1的表达后不同肿瘤细胞（He La细胞及SKOV3细胞）表面MHC-I类分子的表达水平;（2）通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR）实验排除SND1对HLA-A的转录水平的调控;（3）通过改变SND1表达后利用免疫共沉淀技术检测HLA-A蛋白的泛素化水平,来进一步研究SND1是否影响了HLA-A蛋白的降解。（4）最后通过利用质谱分析技术、免疫共沉淀技术及Duolink邻位连接技术,进一步探究SND1促进HLA-A蛋白降解的具体分子机制。第三部分:（1）通过流式细胞术及Western Blot技术来检测敲除SND1后小鼠肿瘤细胞（B16F10细胞及MC38细胞）表面MHC-I类分子（H2Kb）的表达情况;（2）在动物水平通过对小鼠进行皮下成瘤实验,拍照和记录瘤体生长情况,之后通过免疫组化和流式细胞术分析瘤体中免疫细胞的浸润情况;（3）在体外通过克隆形成、CCK8实验检测SND1对小鼠肿瘤细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测SND1对小鼠肿瘤细胞周期和凋亡的影响;（4）在体内通过对比无成熟T细胞的Rag1-/-小鼠及野生型C57BL/6小鼠皮下成瘤后瘤体的生长情况,探究SND1是否通过影响肿瘤细胞在体内的增殖或凋亡,亦或免疫细胞的浸润而影响瘤体的生长;（5）选用OT-I的转基因小鼠模型,研究SND1是否影响CD8+T细胞介导的针对肿瘤细胞表面OVA特异性小肽的免疫应答;（6）通过检索临床样本数据库（TIMER及Progno Scan）,分析病人肿瘤标本中SND1的表达与免疫细胞的浸润及患者的生存期是否有显着的相关性。结果:第一部分:（1）SND1蛋白可与新生的MHC-I类分子的重链HLA-A在体内特异性结合;（2）SND1的SN3结构域与HLA-A的A3结构域酸性氨基酸之间的静电相互作用可能在维持SND1-HLA-A复合物稳定性中起重要作用;（3）SND1蛋白可以通过其N端序列（35aa）结合到SEC61A通道上,而使其定位在内质网上。第二部分:（1）在人的不同肿瘤细胞中,敲除或敲低SND1后,HLA-A蛋白的表达升高,而外源性过表达SND1后,HLA-A蛋白的表达降低;（2）在He La细胞中改变SND1后,HLA-A蛋白的稳定性发生改变,SND1可通过蛋白酶体途径促进HLA-A的降解;（3）免疫共沉淀及Duolink实验显示He La细胞中过表达SND1后会抑制HLA-A与Calnexin及β2m的结合效率,并且HLA-A的糖基化位点突变后不影响HLA-A与SND1的结合;（4）He La细胞中过表达SND1后会促进HLA-A与ERAD（ER-associated degradation,内质网相关的降解）相关复合物（VCP和VIMP）及E3泛素化连接酶HRD1的结合。第三部分:（1）在不同小鼠的肿瘤细胞中敲除SND1后,小鼠的MHC-I类分子（H2Kb）表达升高;（2）小鼠B16F10及MC38细胞皮下成瘤后,SND1敲除后的瘤体更小,并且瘤体里浸润的CD8+T细胞明显增多;（3）SND1在体内和体外对小鼠肿瘤细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响均不明显;（4）在SND1敲除的肿瘤模型中恢复SND1的SN结构域的表达,会使瘤体浸润的免疫细胞发生改变,且瘤体大小也随之改变。（5）转基因OT-I小鼠的实验结果进一步证实了SND1通过影响特异性小肽的抗原呈递,从而影响瘤体组织中CD8+T细胞的浸润。（6）检索TIMER及Progno Scan数据库发现,在黑色素瘤和结肠腺癌中,SND1与CD8+T细胞的浸润及患者的生存期呈负相关。结论:（1）SND1蛋白可通过其N端序列与内质网通道蛋白SEC61A结合而定位于内质网,同时在内质网上其SN结构域与新生的HLA-A结合。（2）SND1在内质网上挟持了新生的HLA-A,抑制了HLA-A与Calnexin及β2m的结合,使其无法形成稳定的结构,不能组装为成熟的MHC-I类分子,并且促进了HLA-A进入ERAD途径发生蛋白酶体相关的降解。（3）肿瘤细胞中SND1通过影响MHC-I介导的抗原呈递作用而影响CD8+T细胞介导的细胞免疫应答,从而促进了肿瘤的生长。此外,临床样本中SND1的表达与CD8+T细胞浸润及患者总体生存率呈负相关。
陈琳[7]（2020）在《气道上皮细胞环鸟苷酸-腺苷酸合成酶在支气管哮喘中的作用及机制研究》文中认为支气管哮喘（简称哮喘）是一种世界范围内最常见的慢性气道炎症疾病,全球目前共有3亿多哮喘患者,我国约有4570多万哮喘病人,极大加重了医疗负担。哮喘是一种异质性疾病,因此需要根据患者的具体情况予以对应的个性化治疗策略。哮喘发病机制十分复杂,尽管学者们已经提出有多种学说,但其内在机理至今仍未完全阐明。近年来气道上皮细胞在哮喘发病中发挥的作用逐渐受到重视,既往研究指出当哮喘患者气道暴露于大气污染物、过敏原和病原体等哮喘致病因子后,可导致气道上皮细胞发生凋亡。此外已有研究证实,细胞凋亡所产生的凋亡细胞DNA（Apoptotic DNA,apop DNA）可作为损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs）与上皮细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）结合并激活一系列免疫炎症反应。释放到胞浆内的apop DNA可被细胞内的DNA识别受体所识别,激活固有免疫信号通路,通过诱导I型干扰素上调和促炎性细胞因子的转录和表达以启动天然免疫防御机制,同时促进获得性免疫应答。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（Cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）是一种DNA识别受体家族中的新成员,它是一种细胞质DNA识别受体,可识别进入细胞质的外源性病毒DNA、质粒DNA、线粒体DNA（Mitochondial DNA,mt DNA）等双链DNA（Double strand DNA,dsDNA）。因此我们提出假设:气道上皮细胞内的cGAS蛋白可通过识别气道局部的dsDNA进而诱导驱动Th2型免疫的细胞因子生成,从而参与哮喘发病机制。目的:研究气道上皮细胞的cGAS蛋白是否通过结合胞浆dsDNA参与哮喘的发病过程以及相关机制的探索。方法:第一部分利用免疫荧光染色检测OVA短时间点干预后不同时间点小鼠气道上皮细胞胞浆内的dsDNA含量和IL-33体外干预HBEs后胞浆内的dsDNA含量是否出现明显升高。此外,通过cGASflox/flox C57BL/6小鼠与本实验室引进的CC10-rt TA/（tet O）7-Cre小鼠交配,获得气道上皮细胞cGAS特异性诱导敲除的小鼠品系(简称cGAS△/△小鼠),然后选取6-8周龄的cGAS△/△小鼠与同窝对照小鼠,利用OVA致敏和激发建立经典哮喘模型,然后检测各组小鼠肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）内炎症细胞的总数,嗜酸性粒细胞比例及绝对值,评估气道炎症浸润情况,粘液分泌水平及气道高反应性,从而进一步明确cGAS对哮喘表型的作用。第二部分利用OVA致敏和激发建立经典哮喘模型和短时间点哮喘模型,评估cGAS敲除后对小鼠肺组织内炎症因子表达水平的影响。同时利用IL-33干预cGAS-si RNA特异性敲除的HBEs,在体外进一步探究cGAS对人体气道上皮细胞炎症因子分泌的影响。另外,利用线粒体特异性抗氧化剂Mito-TEMPO干预IL-33诱导炎症后的HBEs,探究干预后细胞内dsDNA含量和GM-CSF的表达水平变化情况。结果:第一部分OVA短时间点干预人气道上皮细胞后可以明显观察到细胞胞浆内dsDNA含量增加,且为早期出现的一过性增加。在体外IL-33干预HBEs后也可观察到人体气道上皮细胞胞浆内的dsDNA的水平早期一过性升高,且dsDNA与cGAS存在共定位。随后,将气道上皮细胞cGAS敲除后可明显缓解OVA诱导的哮喘气道炎症表型,具体表现为肺泡灌洗液中炎症细胞总数,嗜酸性粒细胞绝对值和比例明显减少,肺部炎症浸润情况呈现出明显缓解,气道粘液分泌明显减少,气道高反应性有所缓解。第二部分在OVA经典哮喘模型中,可观察到敲除cGAS使得肺组织中炎症因子包括IL-4,IL-5,IL-13,IL-25,IL-33的表达水平明显下降,而OVA短时间点模型中发现敲除cGAS使得GM-CSF的m RNA表达水平降低,但对IL-25和IL-33的m RNA表达水平无明显影响。利用IL-33体外干预人气道上皮细胞系后,可稳定上调细胞因子GM-CSF的m RNA表达水平,并且利用cGAS-si RNA敲除HBEs后,GM-CSF的m RNA水平有所下降。而在线粒体特异性抗氧剂Mito-TEMPO干预HBEs后,IL-33诱导产生的GM-CSF和dsDNA均有所降低。结论:cGAS在气道上皮细胞介导哮喘发病过程中扮演重要作用,可能是通过结合胞浆内线粒体损伤后释放出的dsDNA,促进GM-CSF释放以激活Th2型免疫。
杨春华[8]（2019）在《双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究》文中研究说明第一部分构建双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒目的:构建双调控并荷载精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,SPAG9）短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9并验证调控SPAG9蛋白表达的效果。方法:1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒p DD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒p BHGE3（含有腺病毒右臂序列）通过Lipofectamine TM2000共转染至HEK-293细胞内,包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9。2.琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒,通过Cs Cl密度梯度离心法纯化,半数组织细胞感染剂量（Tissue culture infective dose,TCID50）法测定滴度。3.通过Western Blot检测DD3-ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞SPAG9基因的沉默效果。结果:1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,经扩增纯化后,DD3-ZD55-SPAG9的病毒滴度为9.46×10^8 pfu/ml。2.Western Blot结果显示DD3-ZD55-SPAG9可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9蛋白的表达,与对照组相比,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论:成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,并可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9基因的表达第二部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛（Docetaxel,DTX）在体外对去势抵抗性前列腺癌的治疗效果。方法:1.结晶紫染色和CCK-8观察各组对前列腺癌PC-3和DU145与正常前列腺细胞WPMY-1细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组对PC-3和DU145细胞迁移侵袭能力的抑制。3.Hoechst-33258染色实验检测各组PC-3和DU145细胞的凋亡。4.Western Blot实验检测PC-3和DU145细胞内SPAG9,侵袭和凋亡相关蛋白的表达。结果:1.结晶紫染色结果:各病毒治疗组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性,DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性,各组处理48小时后,高浓度的DTX（>4ng/ml）,高滴度的ZD55-SPAG9（MOI>20）会对WPMY-1细胞产生毒性作用,而DD3-ZD55-SPAG9在MOI>50时才会对WPMY-1细胞产生毒性作用,提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更高的安全性。2.CCK-8结果:随病毒和药物作用时间的延长,对前列腺癌细胞的增殖抑制效果均逐渐增强,且随病毒滴度和药物浓度的升高,对细胞的增殖抑制效果也逐渐增强。感染48小时后,联合组对前列腺癌细胞的增殖抑制效果明显高于各单一治疗组。各处理组48小时后WPMY-1细胞增殖较对照组无明显差异。3.划痕实验结果:24小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组,且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组。4.Transwell实验结果:48小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组,联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组。5.Hoechst-33258染色结果:48小时后,各治疗组的细胞凋亡率均高于PBS组,且联合组细胞凋亡率明显高于单一组。6.Western Blot实验结果显示:各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组,侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组,Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。联合组内SPAG9,Vimentin,MMP-2的表达量明显低于单治疗组,同时E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组。结论DD3-ZD55-SPAG9可以在体外有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并可以有效诱导PC-3和DU145凋亡,效果略低于ZD55-SPAG9,但对WPMY-1细胞具有更高的安全性。对前列腺癌细胞侵袭能力的抑制作用,其机制之一可能是沉默SPAG9基因表达后,通过调控与上皮细胞间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关蛋白,上调E-cadherin,下调Vimentin,MMP-2的表达有关。对前列腺癌细胞凋亡诱导机制可能是通过促进caspase8与caspase3介导的内源性凋亡实现,联合使用多西他赛可起协同作用,增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。第三部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛对裸鼠移植瘤的治疗效果。方法:1.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型。监测不同处理组对移植瘤的生长的影响。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组肿瘤的生长状况。2.原位末端缺口标记法（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。3.免疫组化和Western Blot检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。结果:1.成功构建裸鼠移植瘤,各治疗组肿瘤生长速度均低于对照组,HE结果显示各治疗组内均存在肿瘤细胞凋亡坏死,联合组更为明显。2.TUNEL结果显示各治疗组内均存在明显的肿瘤细胞凋亡,联合治疗组较单一治疗组凋亡现象更为明显。3.免疫组化和Western Blot结果显示各治疗组内SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增多,联合组对上述蛋白的表达调控更为显着。结论:DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,并促进移植瘤细胞凋亡,抑制SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达,促进E-cadherin蛋白表达。但效果略低于ZD55-SPAG9。联合使用多西他赛后可以获得较单一治疗更高的移植瘤治疗效果。
乔冠恩[9]（2019）在《miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究》文中研究表明目的:本实验主要研究食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织中miR-106b-3p的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验确认miR-106b-3p的差异表达能够影响ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程。通过Target Scan以及双荧光素酶报告实验预测及验证miR-106b-3p在ESCC调控中的靶基因。最后,深入探讨miR-106b-3p调控ESCC恶性生物学功能的机制。方法:1、收集苏州大学附属第一医院和邯郸市第一医院的ESCC组织和癌旁样本3对,应用Agilent miRNAs表达谱芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2、RT-qPCR检测差异比较大的miR-106b-3p的表达水平;3、RT-qPCR检测miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;MTT-8和克隆形成实验检测ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）的增殖能力;4、将合成的miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors转染至ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中,RT-qPCR检测转染效率;MTT和克隆形成实验检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）增殖能力的影响,流式周期实验观察对周期分布的影响,Western blot实验观察对细胞周期、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达的影响,划痕实验观察对细胞非定向迁移能力的影响,Transwell迁移实验观察对细胞定向迁移能力的影响,Transwell侵袭移实验观察对细胞侵袭能力的影响,光镜观察细胞形态的变化,细胞黏附实验观察对细胞黏附能力的影响;5、构建ESCC细胞株（ECA109）裸鼠移植瘤模型,观察miR-106b-3p对ESCC细胞株移植瘤生长的作用;6、免疫荧光和Western blot实验检测ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验检测ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors后ZNRF3 m RNA和蛋白的表达;Target Scan预测miR-106b-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR和Western blot检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、利用Agilent miRNAs表达谱芯片筛选出62个ESCC差异表达的miRNAs,其中ESCC表达上调的miRNAs 41个,下调的miRNAs 21个;2、RT-qPCR实验结果显示miR-106b-3p在ESCC临床组织样本的表达水平要显着高于其在癌旁中的表达;3、RT-qPCR结果显示miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）中的表达要显着高于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）的表达;MTT和克隆形成实验结果显示ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的增殖能力要显着高于人正常食管上皮细胞（HET-1A）;4、转染miR-106b-3p inhibitors后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着降低,转染miR-106b-3p mimics后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着升高;MTT实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）的增殖能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的增殖能力显着增强;克隆形成实验验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的克隆形成能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的克隆能力显着增强;流式周期实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株细胞阻滞在G1期,而转染miR-106b-3p mimics后的G1比例显着下调,且miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Cyclin D1蛋白的表达,促进p21和p27的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Cyclin D1蛋白的表达,抑制p21和p27的表达;划痕实验和Transwell迁移表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的迁移能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的迁移显着增强;Transwell侵袭实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的侵袭能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的侵袭显着增强;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进MMP-2和MMP-9蛋白的表达;细胞形态和黏附实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够抑制ESCC细胞株对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附,而miR-106b-3p mimics能够增强对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达;5、裸鼠移植瘤实验表明,抑制miR-106b-3p的表达能够显着抑制移植瘤的生长,而促进miR-106b-3p的表达则显着促进移植瘤的生长;6、免疫荧光和Western blot实验表明ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的表达要显着低于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验结果表明,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着降低,转染miR-106b-3p inhibitors后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着升高;Target Scan预测ZNRF3是miR-106b-3p的潜在靶基因,且双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR结果显示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin m RNA的表达,促进GSK3βm RNA的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin m RNA的表达,降低GSK3βm RNA的表达。Western blot实验示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,上调p-GSK3β蛋白的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin蛋白的表达,降低p-GSK3β蛋白的表达。结论:1、miR-106b-3p在食管鳞癌临床样本中显着高表达;2、miR-106b-3p可以显着促进食管鳞癌细胞株的增殖、周期、迁移、侵袭、黏附及EMT进程;能够显着促进食管鳞癌细胞移植瘤的生长;3、miR-106b-3p能够靶向作用于ZNRF3;4、miR-106b-3p可以显着促进Wnt/β-catenin信号通路的表达。
黄艳平[10]（2019）在《K562工程细胞系的构建及对NK-92细胞体外扩增的研究》文中认为目的:用分子克隆技术构建3种慢病毒载体,并用以它们为媒介制备的基因修饰的K562细胞系作为饲养层细胞,在体外扩增出高细胞毒活性的NK-92细胞,为后续CAR-NK-92细胞的体外扩增提供实验依据。方法:在慢病毒载体pWPI含有报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的基础上,分别插入目的基因白细胞介素-15（Interleukin-15,IL-15）、白细胞介素-21（Interleukin-21,IL-21）和4-1BB配体（4-1BB ligand,4-1BBL）,构建出3种慢病毒表达载体。慢病毒包膜蛋白质粒VSV-G、包装质粒ps PAX2、慢病毒表达载体4-1BBL分别和慢病毒表达载体IL-15、IL-21共转染HEK293FT细胞,浓缩2种细胞培养上清液,得到慢病毒液,并用慢病毒液感染K562细胞。利用显微注射技术挑选并扩大培养得到能够稳定表达GFP基因的K562细胞,经丝裂霉素C（Mitomycin C,MMC）处理后作为饲养层细胞,体外扩增NK-92细胞。通过CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测体外扩增后NK-92细胞毒性,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放法检测NK-92细胞活性,酶联免疫分析（ELISA）检测NK-92细胞上清中γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）的水平,验证扩增后NK-92细胞的功能及安全性。结果:酶切鉴定和测序结果证明3种慢病毒载体构建成功;通过荧光显微镜观察到2组慢病毒表达载体转染HEK293FT细胞以及慢病毒液感染K562细胞后GFP的表达;流式结果显示两组细胞中,4-1BBL的阳性表达率均较高;终浓度为10μg/ml的MMC溶液处理K562细胞3 h可以得到良好的饲养层细胞;IL-15组K562细胞作为饲养层细胞扩增出更多数量的NK-92细胞;CCK-8结果显示随着效靶比的逐渐增加,IL-15组作为饲养层细胞扩增后的NK-92细胞毒性高于其余各组（P<0.05）;效靶比为10:1时,IL-15组细胞上清中LDH的活性、IFN-γ的含量有所升高（P<0.05）。结论:构建含有报告基因GFP和目的基因IL-15、IL-21、4-1BBL的慢病毒载体与慢病毒包装载体制备的慢病毒液感染K562细胞后,表达绿色荧光蛋白和目的基因IL-21/4-1BBL的K562细胞系构建成功。IL-15和4-1BBL联用制备出的K562细胞作为饲养层可体外扩增出高细胞毒活性和有效抗肿瘤细胞A549细胞活性的NK-92细胞。
二、Identification of a New Member of the Ep-CAM (17-1A) Tumor-Associated Antigen Family（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Identification of a New Member of the Ep-CAM (17-1A) Tumor-Associated Antigen Family（论文提纲范文）
（1）ILK影响食管鳞癌细胞对铂类化疗药物敏感性的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 试验方法 |
| 3 统计学方法 |
| 4 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 食管鳞状细胞癌免疫治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（2）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（4）基于TCGA数据库人脑胶质瘤的生物信息学分析以及KNL1在人脑胶质瘤中的表达情况及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 1 前言 |
| 2 资料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 癌症/睾丸抗原家族及KNL1的研究相关进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介、在读期间发表论文情况及获得荣誉 |
| 致谢 |
（5）MAGE-A3基因对宫颈癌增殖侵袭迁移的影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 MAGE-A3在宫颈癌组织中的表达及与预后的关系研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MAGE-A3在宫颈癌细胞系中的表达 |
| 1 目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 1 目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 MAGE-A3基因与Wnt信号通路在宫颈癌中的关系研究 |
| 1 研究背景及目的 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 MAGE-A3基因对于裸鼠体内成瘤的影响 |
| 1 目的和意义 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 创新与特色 |
| 展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 成果 |
| 致谢 |
（6）肿瘤蛋白SND1通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递作用促进肿瘤免疫逃逸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SND1与HLA-A结合的机制探讨 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 主要溶液、缓冲液和培养基 |
| 1.1.5 主要仪器和设备 |
| 1.1.6 实验方法及流程 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 SND1 蛋白参与复合物的质谱分析及体内验证与HLA-A蛋白结合 |
| 1.2.2 SND1与HLA-A蛋白直接相互作用的结构域 |
| 1.2.3 SND1蛋白是潜在的内质网相关蛋白 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、SND1 调控HLA-A蛋白的分子机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要溶液、缓冲液和培养基 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.1.6 实验方法及流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SND1与HLA-A蛋白表达呈负相关 |
| 2.2.2 SND1 促进HLA-A蛋白的降解 |
| 2.2.3 SND1 抑制HLA-A的正常加工使其进入ERAD途径降解 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、SND1 通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递而影响瘤体中CD8~+T 细胞的浸润 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 主要溶液、缓冲液和培养基 |
| 3.1.5 主要仪器和设备 |
| 3.1.6 实验方法及流程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SND1 通过影响CD8~+T 细胞的浸润而影响瘤体的生长 |
| 3.2.2 SND1对小鼠肿瘤细胞的增殖,周期和凋亡影响不明显 |
| 3.2.3 SND1的SN结构域通过影响小鼠瘤体CD8~+T细胞的浸润而影响瘤体的生长 |
| 3.2.4 SND1 通过影响肿瘤细胞MHC-I类分子的特异性抗原呈递作用而影响瘤体中CD8~+T细胞的浸润 |
| 3.2.5 临床样本中SND1 的表达与CD8~+T 细胞浸润及患者总体生存率呈负相关 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤细胞发生免疫逃逸的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）气道上皮细胞环鸟苷酸-腺苷酸合成酶在支气管哮喘中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 气道上皮细胞cGAS参与调控哮喘发病 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.3 主要实验材料与试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 OVA短期模型中小鼠上皮细胞胞浆内dsDNA出现一过性升高 |
| 3.2 利用IL-33 干预人气道上皮细胞系(HBEs)后胞浆内dsDNA一过性增多 |
| 3.3 IL-33 干预HBE后胞浆内dsDNA与 cGAS蛋白结合 |
| 3.4 构建cGAS气道上皮细胞选择性敲除工具小鼠 |
| 3.5 cGAS气道上皮选择性敲除可显着缓解OVA诱导的哮喘气道炎症 |
| 3.6 cGAS气道上皮选择性敲除可以降低气道粘液高分泌与高反应性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 气道上皮细胞cGAS对哮喘调控的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.3 主要实验材料与试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 数据统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 cGAS气道上皮选择性敲除下调肺组织哮喘相关炎症因子的表达 |
| 3.2 OVA短期模型中敲除cGAS使小鼠肺组织GM-CSF表达水平降低 |
| 3.3 通过si RNA敲除HBE细胞cGAS后炎症因子GM-CSF表达降低 |
| 3.4 Mito-TEMPO可部分缓解dsDNA与 GM-CSF升高 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性 |
| 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 cGAS-STING信号通路及其在疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建双调控并荷载SPAG9 基因shRNA的溶瘤腺病毒 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、质粒、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 |
| 2.DD3-ZD55-SPAG9 的扩增、纯化与滴度测定 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 抑制前列腺癌细胞内SPAG9 蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.结晶紫染色检测DD3-ZD55-SPAG9+DTX对细胞的毒性作用 |
| 2.溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9 及多西他赛抑制前列腺癌细胞的生长 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞迁移能力 |
| 4.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞侵袭能力 |
| 5.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX促进前列腺癌细胞凋亡 |
| 6.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX下调SPAG9、Vimentin、MMP-2 蛋白,上调E-cadherin、caspase-8、casepase-3 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制裸鼠移植瘤生长 |
| 2. HE 染色 |
| 3.TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤凋亡 |
| 4.免疫组化法检测肿瘤组织中SPAG9 蛋白与EMT相关蛋白 |
| 5.Western Blot检测肿瘤组织内SPAG9和EMT相关蛋白表达情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究创新 |
| 存在的问题和改进方法 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 溶瘤腺病毒介导的抗肿瘤治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 嵌合抗原受体 T 细胞免疫治疗前列腺癌现状及进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 Abbreviation |
| 攻读学位期间参与发表的学术成果 |
| 致谢 |
（9）miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 食管鳞癌组织中microRNAs差异表达谱的筛选及研究 |
| 1.1 差异表达谱的筛选 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 结果 |
| 1.1.4 讨论 |
| 1.1.5 结论 |
| 1.2 食管鳞癌组织miR-106b-3p的研究 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.3 结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR-106b-3p对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 2.1 对体外细胞生物学功能的影响 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 对裸鼠移植瘤的影响 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-106b-3p调控食管鳞癌分子机制研究 |
| 3.1 miR-106b-3p的靶基因验证及二者关系 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 结论 |
| 3.2 miR-106b-3p对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述:食管癌相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
（10）K562工程细胞系的构建及对NK-92细胞体外扩增的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 用于扩增 NK-92 细胞的 K562 工程细胞系的构建 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 第二部分 NK-92 细胞的体外扩增及其功能的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 中英文术语和缩略词对照表 |
| 附录 B 主要试剂配制方法 |
| 附录 C 个人简历 |
| 附录 D 发表文章 |
| 附录 E 综述 |
| 参考文献 |
四、Identification of a New Member of the Ep-CAM (17-1A) Tumor-Associated Antigen Family（论文参考文献）
- [1]ILK影响食管鳞癌细胞对铂类化疗药物敏感性的研究[D]. 潘好奇. 新疆医科大学, 2021(02)
- [2]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [3]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [4]基于TCGA数据库人脑胶质瘤的生物信息学分析以及KNL1在人脑胶质瘤中的表达情况及其临床意义[D]. 高育源. 郑州大学, 2020(02)
- [5]MAGE-A3基因对宫颈癌增殖侵袭迁移的影响及机制的研究[D]. 高新萍. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]肿瘤蛋白SND1通过抑制MHC-I类分子的抗原呈递作用促进肿瘤免疫逃逸[D]. 王媛. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]气道上皮细胞环鸟苷酸-腺苷酸合成酶在支气管哮喘中的作用及机制研究[D]. 陈琳. 浙江大学, 2020(01)
- [8]双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究[D]. 杨春华. 苏州大学, 2019(06)
- [9]miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究[D]. 乔冠恩. 苏州大学, 2019(06)
- [10]K562工程细胞系的构建及对NK-92细胞体外扩增的研究[D]. 黄艳平. 蚌埠医学院, 2019