一、携带免疫刺激DNA序列的载体及人工合成免疫刺激DNA对HBV核心区基因免疫的影响（论文文献综述）
兰婷钰[1]（2021）在《基于RNAi和CRISPR/Cas技术复合系统的抗HBV作用及其机制研究》文中研究表明目的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的全球性公共卫生疾病,是导致肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌的主要病因。乙型肝炎的治疗虽然取得了长足进展,但是HBV感染的“功能性治愈”率仍然很低。由于HBV的高水平复制和基因表达引起免疫耐受,因此增强特异性细胞和体液免疫是控制HBV感染的关键因素。同时,肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,ccc DNA）的稳态水平是HBV持续感染和久治不愈的根源,现有的治疗方案不能直接作用于ccc DNA,而基因编辑技术可以直接对基因组DNA进行剪切和编辑。所以本研究首先探讨引入非配对的类似miRNA的尿嘧啶环状突起的新型siRNA（microRNA like siRNA,msiRNA）激活天然免疫,从而增强siRNA抗HBV作用;然后通过设计靶向HBV DNA的CRISPR/Cas基因编辑系统剪切/清除HBV基因组。并构建shRNA和CRISPR/Cas复合系统,从RNA干扰和基因编辑两方面探讨清除HBV的治疗方法。方法设计合成针对HBV S基因和X基因的msiRNA（分别命名为msiHBs和msiHBx）。msiRNA/siRNA分别与HBV可复制型质粒p HY106-wta或p HY106-X15共转染HepG2细胞,或msiRNA/siRNA分别直接转染HepG2.215细胞,ELISA检测上清HBs Ag、HBe Ag和细胞因子TNF-α、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-6表达水平,PCR检测细胞培养上清HBV DNA、细胞内HBVRNA和HBV复制中间体水平,Southern blotting检测HBV复制中间体水平。msiRNA/siRNA转染PBMC后ELISA检测分泌细胞因子IFN-α和IFN-β水平,病毒保护试验检测细胞培养上清中I型IFN的活性。设计构建靶向HBV C、S、X基因的sgRNA（分别命名为sg C1、sg C2、sg C3、sg S2、sg S3、sg S4、sg X1、sg X2和sg X3）。体外转录各sgRNA后与重组Cas9蛋白组合后体外剪切PCR扩增的HBV DNA片段,凝胶电泳检测剪切效率。以px459-Cas9-puro质粒为骨架构建靶向HBV DNA的Cas-C3、Cas-S4、Cas-X1的质粒,分别与HBV复制型质粒p HY106-wta共转染HepG2细胞,同时构建CRISPR/Cas慢病毒（Lenti-Cas-C3、Lenti-Cas-S4、Lenti-Cas-X1）感染HepG2.2.15细胞。ELISA检测细胞培养上清HBs Ag和HBe Ag含量。Western blotting检测细胞内HBc Ag含量。RT-PCR和Southern blotting检测HBV复制中间体水平。T7EI和测序检测Lenti-Cas-C3慢病毒感染HepG2.2.15细胞后HBV DNA突变率。以质粒px458-Cas9-EGFP为骨架,构建表达靶向HBV X基因的shHBx和靶向HBV C、X基因的双靶位sgRNA/Cas的质粒,与HBV复制型质粒p HY106-wta共转染HepG2细胞。ELISA检测细胞上清中HBs Ag和HBe Ag的表达,Western blotting检测细胞内HBs Ag和HBc Ag的表达。结果在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中,msiRNA可显着降低HBs Ag（至阴性水平）、上清HBV DNA（95.5%）和核内HBV复制中间体（89.8%）水平,与普通siRNAs组相比无统计学差异（P>0.05）。同时,在转染了HBV复制型质粒的HepG2细胞,与siRNA相比,msiHBx处理后抗病毒因子TNF-α（3.3倍）、IFN-α（1.4倍）、IFN-β（2.5倍）表达水平显着增加（P<0.01）,且不增加促炎性细胞因子IL-1α、IL-6表达水平。病毒保护实验结果显示,msiHBx介导的I型IFN可以保护L929细胞免受ECMV病毒感染。体外转录的各sgRNA/Cas9有效剪切HBV DNA（效率均大于50%）。其中Cas-C3、Cas-S4、Cas-X1剪切效率较高,分别达到68.7%、64.6%、54.4%,且此三个sgRNA/Cas9相互组合后完全剪切HBV DNA（100%）。在HBV瞬时复制系统中,sgRNA/Cas9可显着减少HBs Ag和HBe Ag（80%）、HBc Ag（60.9%）和核内HBV复制中间体（67%）水平,与空载体对照组相比有统计学差异（P<0.001）。在HepG2.2.15细胞中,实验组HBs Ag含量与空载体对照组间无统计学差异（P>0.05）,但Cas-C3、Cas-X1处理组HBe Ag水平明显减低（P<0.01）。实验组细胞内HBc Ag均不同程度明显减少（可达约50.4%）。Cas-C3慢病毒感染HepG2.2.15细胞后HBV DNA突变率约53%。与vector组相比,shHBx-Cas-C/X复合编辑系统的HBs Ag和HBe Ag分别减少2.3倍,2.5倍;与单靶位（Cas-C）相比,双靶位（Cas-C/X和shHBx-Cas-C/X）的HBs Ag水平分别减少2倍,4.1倍;与双靶位（Cas-C/X）相比,shHBx-Cas-C/X复合系统的HBs Ag和HBe Ag分别减少2.1倍,2倍。Western blotting检测细胞内HBs Ag和HBc Ag的表达,结果显示相对于vector组,所有实验组HBs Ag、HBc Ag的表达均明显减少,shHBx-Cas-C/X复合编辑系统组的HBs Ag、HBc Ag水平最低。结论msiRNA有效抑制HBV表达和复制水平。msiRNA增强抗病毒因子水平的同时不激活炎症反应,msiRNA的这种兼具RNAi和免疫刺激的活性可能在HBV感染控制中发挥重要作用。CRISPR/Cas有效抑制HBV表达和复制水平,从基因水平清除HBV复制和持续感染的根源。基因编辑联合免疫调节治疗,上调/恢复抗HBV免疫应答可以促进基因编辑后残存HBV DNA的清除,这种RNAi-CRISPR/Cas复合编辑系统在体内对于HBV感染的清除作用值得进一步深入研究,从而为实现HBV感染的完全治愈探索新策略。
曾杰[2]（2020）在《核酸无膜细胞器的研究》文中研究表明背景:核酸纳米结构包括DNA纳米结构和RNA纳米结构。目前,研究人员已成功构建了一系列结构精巧、功能广泛的核酸纳米结构,这些核酸纳米结构的精巧程度通常和参与组成的核酸链的数量呈正相关,但是大量的核酸链参与组装纳米结构,不仅增加了合成成本,也使实验操作变得繁琐。因此,简单的核酸链组成和组装过程,将会是一种理想的核酸结构构建方式。根据中心法则,目前建立的方法可在不同水平沉默目的基因,在转录后水平发生的基因沉默,被称为转录后基因沉默。当前建立的转录后基因沉默方法多集中于细胞质中,缺少对细胞核内RNA直接干扰的方法,将具有简单的核酸链组成、较好的可编程性和生物相容性的核酸纳米结构应用于此领域,将会建立一种安全有效的基因沉默新方法。核酸无膜细胞器是指细胞内由核酸组成的无膜聚集体,目前对其形成机制和功能的体内外研究资料都较少,而将核酸纳米结构领域与无膜细胞器领域结合,可促进二者的共同发展。目的:1构建组成成分简单、组装便捷和功能广泛的DNA纳米结构和RNA纳米结构;2建立一种可在细胞核内阻断mRNA翻译的基因沉默新方法;3将核酸纳米结构领域和无膜细胞器领域相结合,促进二者共同发展。方法与结果:1 DNA无膜细胞器的设计、组装及表征根据回文序列特征和利用Tiamat软件设计了两组（具尾和不具尾）多回文结构域的DNA序列。通过一步退火法组装两组多回文结构域的DNA,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）和琼脂糖凝胶电泳观察到两组DNA均自组装形成高分子量聚集体,且随着回文结构域数目的增加,形成的聚集体更大。进一步利用激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）观察到组装后的两组DNA均可形成微米级颗粒;将两组DNAμPs低速离心后,发现其均具有相分离性质,因此将组装形成的DNA纳米结构称为DNA无膜细胞器–DNA微米颗粒（DNA microparticles,DNAμPs）。离心分离法半定量结果表明各不具尾DNAμPs的产率无明显差异,约为96%;具尾DNAμPs的产率随着回文结构域数目的增加,逐渐提高,产率范围为90%–20%。通过LSCM和离心分离法发现DNA浓度和镁离子浓度可影响具尾DNAμPs的组装,随着DNA浓度的减小,DNAμPs粒径逐渐减小,当DNA浓度为0.63μM时,观察不到DNAμPs;随着镁离子浓度的增加,DNAμPs聚集程度逐渐增加,当镁离子浓度为22.5 mM时,DNAμPs相互融合形成大聚集体,有明显相分离现象;而当镁离子浓度为3 mM时,仅观察到极少量疏松的网状DNA,无明显相分离现象。2 DNA无膜细胞器对巨噬细胞免疫刺激作用及单链DNA的捕获作用研究将硫代磷酸化的CpG 1826（CpG 1826–phosphorothioate,CpG 1826–ps）连接到4条多回文结构域DNA的3’端,成功设计并组装了4条多回文结构域的免疫刺激CpG–DNAμPs。酶联免疫吸附试验（enzyme–linked immunosorbent assay,ELISA）结果显示各CpG–DNAμPs均可增强巨噬细胞分泌免疫因子IL–6、IL–12和TNF–α。细胞计数试剂盒–8（cell counting kit–8,CCK8）实验表明CpG–DNAμPs对RAW 264.7巨噬细胞的存活率无影响。非变性PAGE实验证明具尾DNAμPs在体外可捕获单链DNA（T）,在37°C时,各具尾DNAμPs对T链的捕获率约为50%;在22°C时,7 PA对T链的捕获效率约为88%,其余3种类型的具尾DNAμPs对T链的捕获率约为100%。3 DNA无膜细胞器捕获癌细胞中致癌miR–21,从而致死癌细胞的作用研究将反义寡核苷酸21（antisense oligonucleotide 21,ASON 21）连接到多回文结构域DNA的3’端,设计成不同回文结构域数目的DNAμP21（n P21,n=1–7）。通过一步退火法组装各组DNAμP21,利用LSCM观察到7 P21、6 P21、5 P21、4 P21和3 P21呈颗粒状,2 P21、1 P21不易形成颗粒状。非变性PAGE实验发现DNAμP21在体外均可不同程度的捕获miR–21,7 P21的捕获率约为40%,6P21、5 P21和4 P21的捕获率约为85%,其余DNAμP21的捕获率约为100%。LSCM观察到各DNAμP21组的细胞核（蓝色荧光）周围有大量Cy 3–DNAμP21（红色荧光）,表明DNAμP21已进入MCF–7乳腺癌细胞。实时荧光定量PCR（real–time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）实验发现DNAμP21可下调MCF–7乳腺癌细胞中miR–21水平,随着回文结构数目的减少,DNAμP21对miR–21水平的下调作用逐渐增强。CCK8实验结果表明DNAμP21可致死MCF–7乳腺癌细胞,随着回文结构域的减少,DNAμP21对MCF–7乳腺癌细胞的致死作用逐渐增强;随着给药时间的增加,21–1 P对MCF–7乳腺癌细胞的致死作用逐渐增强,当给药时间为72 h时,细胞存活率约为30%;随着给药量的增加,21–1 P对MCF–7乳腺癌细胞的致死作用逐渐增强,当给药量达到2400 nM时,细胞存活率约为30%。4 RNA无膜细胞器的设计、组装及表征利用多回文结构域的DNA在体外转录得到多回文结构域的RNA（7 C、6 C、5 C和4 C）。通过琼脂糖凝胶电泳、非变性PAGE和LSCM实验分别考察退火程序和镁离子浓度对RNA无膜细胞器–RNA微聚体（RNA microaggregations,RNAμAs）组装的影响,结果表明镁离子的存在有利于RNAμAs的形成,高温退火程序会阻碍RNAμAs形成,并且根据体内具有恒温和丰富的离子环境,推测出RNAμAs适用于体内的自组装。5 RNA无膜细胞器的基因沉默作用研究从构建的重组质粒GFP–pcDNA3.1、7 P+GFP–pcDNA3.1和NC+GFP–pcDNA3.1中扩增GFP、7 C+GFP和NC+GFP的DNA,并通过体外转录获得对应的mRNA,将转录得到的GFP、7 C+GFP和NC+GFP的mRNA通过琼脂糖凝胶分析,实验结果表明RNAμAs可降低GFP mRNA在琼脂糖凝胶中迁移率。将重组质粒给予Hela细胞48 h后,分别通过LSCM、流式细胞术和蛋白免疫印迹法检测GFP表达量,结果显示RNAμAs可抑制Hela细胞中GFP的表达,沉默效率约50%。CCK8和蛋白免疫印迹法实验结果表明RNAμAs对Hela细胞存活率和细胞内功能无影响。研究结论:1成功构建了仅由一条链组装的DNA无膜细胞器–DNAμPs,此DNAμPs可应用于运载功能性核酸药物进入细胞,从而增强免疫反应和抑制癌细胞增殖;2成功构建了仅由一条链组装的RNA无膜细胞器–RNAμAs,并推测此RNAμAs适用于体内自组装;3初步建立了一种转录后基因沉默的新方法:利用体内自组装形成的RNAμAs,捕获目的蛋白的mRNA,从而阻止目的蛋白的mRNA进入细胞质,进而阻碍目的蛋白的表达;4将核酸纳米结构领域与无膜细胞器领域相结合,促进二者共同发展。
王丹阳[3]（2018）在《基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究》文中研究表明NF-κB是一种序列特异性DNA结合转录因子。在未激活状态下,NF-κB与其抑制蛋白IκB结合滞留在细胞质中。当细胞受到刺激,如病毒感染、紫外线照射、细胞因子（TNFα等）作用下,通过细胞内的NF-κB信号传导通路,抑制蛋白IκB降解,NF-κB进入细胞核,与核内DNA靶点结合,控制其众多靶基因的表达,从而参与细胞生长、分裂、凋亡、更新、炎症、癌变等生理及病理过程。NF-κB在炎症和癌症中被广泛激活,因此一度成为药物筛选和疾病治疗的重要靶点,如各种NF-κB抑制剂的开发。但由于NF-κB所具有的双刃剑作用,传统NF-κB抑制剂因其显着的副作用而始终未成为临床药物。因此,基于NF-κB的生物医学应用价值的探索需要新的研究策略。本研究发展了三种基于NF-κB的新型基因表达控制技术,并探索了其生物医学应用价值。1.基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究人巨细胞病毒（hCMV）主要早期启动子（MIEP）是目前生命科学基础研究和各类基因工程、基因治疗、基因编辑中广泛使用的活性最高的真核启动子。本研究用指数富集（SELEX）系统筛选获得的高亲和力人工序列替换人MIEP中的天然NF-κB结合位点（κBs）,构建了各种突变型的MIEP（mMIEP）。通过多种转录活性评价系统的检测,本研究成功筛选出了3个转录活性显着高于野生型MIEP的mMIEP。这些mMIEP作为人工启动子可以广泛用于基因工程药物生产及基因治疗领域。此外,本研究为启动子工程提供了一个快速构建和筛选各种活性启动子的新方法,并且制备了一系列具有多种转录活性的mMIEPs,可用于未来合成生物学中目的基因表达水平的灵活控制。本研究将改造的人工启动子应用于hG-CSF蛋白的分泌表达,针对该蛋白的表达研究不仅可以深入的验证启动子表达效率,还为mMIEP启动子在基因工程制药的应用提供了重要依据。2.新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究已有研究证明,NF-κB通过调控其靶基因,在肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭转移等过程中起重要作用。而且很多研究表明,NF-κB家族蛋白在肿瘤组织细胞中的表达量比在正常组织细胞中有明显的增强。NF-κB已经成为新型药物治疗和研发的重要靶点。因此,研究人员开发了很多不同的NF-κB抑制剂,但由于NF-κB不仅是疾病相关的转录因子,它在细胞的正常生理功能中也发挥重要作用,对其进行过强的抑制会产生严重的副作用,这些抑制剂很难成为商品化的临床药物。为了克服这一局限性,本研究中将经典的NF-κB特异诱骗子（decoy）序列作为一种NF-κB特异性启动子元件,与最小启动子序列融合,构建了一种NF-κB调控启动子（decoy minimal promoter,DMP）。本研究以此启动子构建了一种新型NF-κB活性控制基因载体,该载体能够在DMP启动子的控制下表达靶向于NF-κB RelA的人工miRNA。本研究证实,这种载体可以对细胞内NF-κB活性进行感知和调控。载体在细胞内的表达可以形成一个完美的反馈循环,实现NF-κB的自我调控。将载体转染到细胞内后,NF-κB的活性越高,DMP启动子的转录活性也就越高,amiRNA的表达量也就越高。DMP-amiRNA系统能够适度的抑制NF-κB过度活化细胞（如肿瘤细胞）内的NF-κB活性,引起肿瘤细胞的凋亡,但对正常细胞的不产生显着影响。本研究通过筛选,获得一种效果良好的新型NF-κB活性抑制剂——DMP-amiR533。本研究不仅发展了一种抑制NF-κB活性的新策略,所筛选获得的DMP-amiR533在治疗炎症和癌症等NF-κB过度活化疾病中具有重要应用价值。3.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体构建及其应用研究近年来,免疫疗法对癌症治疗有很大贡献,但是,肿瘤细胞特异性抗原仍然是目前癌症免疫疗法最关键的限制因素。因此,研究人员正在通过肿瘤测序和生物信息学预测等方法寻找新抗原来开发个性化癌症免疫疗法,但该策略技术复杂性高、成本高、周期长。本研究通过开发肿瘤细胞特异性基因表达技术,构建了一种癌症的新型免疫疗法,该技术使用NF-κB特异性基因表达载体在肿瘤细胞表面表达特定的蛋白质或多肽,这些蛋白质或多肽可以作为人造新抗原起作用,用于区分肿瘤细胞和正常细胞并刺激免疫系统杀死肿瘤细胞。本研究构建并验证了NF-κB活化基因表达（NF-κB-activating gene expression,Nage）载体系统,该载体利用DMP启动子,使载体携带的下游效应基因可以在各种肿瘤细胞表面特异性表达某种蛋白质或多肽,如HBsAg、CRT和SBP。本研究将Nage载体包装在腺相关病毒（AAV）中,作为肿瘤免疫治疗的病毒载体药物,最终结果显示,重组AAV可以显着抑制体内肿瘤的生长,并且在实验鼠上未观察到毒副作用。本研究中提出的新型癌症基因免疫疗法在癌症治疗领域具有重要应用价值。总之,本研究发展了基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术,获得了转录活性显着提高的新型启动子（mMIEP）、新型NF-κB活性控制载体（DMP-amiR533）,以及NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体（Nage）;这些基于NF-κB的新型基因表达控制技术在生物制药及基因治疗领域具有重要应用价值。
刘栋[4]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中研究说明在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
田浪[5]（2009）在《禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究》文中研究说明禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位（主要是中和抗原表位）和T细胞表位（主要是CTL抗原表位）,同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7（S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA）。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5’端引入Kozak序列,3’端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a（+）,转化E.coli Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗（HRP标记兔抗鸡IgG）最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高（血清稀释度可达1∶300）、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。4、采用本课题组获得专利（专利授权号为200410081443.4）的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价,二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率;同时对pVAX1-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d,与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显着（P＜0.05）。ELISA抗体效价结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d,与pcDNA-F疫苗组相比差异均显着（P＜0.05）。攻毒结果表明,pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80%、80%和75%,前两者优于常规灭活疫苗（75%）。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85%、90%和85%,表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-1β和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示,pVAX1-F免疫接种后24h,在血液和所有检测的组织中检测到质粒,免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗,研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫,免疫鸡攻毒保护率为80%,高于常规IBV灭活疫苗（75%）;与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90%;该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好,未检测到与宿主基因组整合的现象。本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究,在国内外未见报道,该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。
张亚丽[6]（2008）在《小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究》文中研究说明感染HBV能导致急性、慢性肝炎,与肝硬化及肝细胞癌有密切关系。目前,控制HBV感染的有效方法是接种乙肝疫苗。基因疫苗的兴起和发展为乙型肝炎病毒感染的防治提供了新的途径。基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,在乙型肝炎病毒的清除方面具有较好的应用前景,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗。核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大,某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱,难以诱导有效的T、B细胞免疫应答,提高核酸疫苗的免疫效果已成为研究热点。基因佐剂是将编码某些细胞因子及T、B细胞表面共刺激分子等的基因与目的基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物,其表达的相应蛋白可起到佐剂的作用,从而大大增强T、B细胞的免疫应答水平。LIGHT是TNF配体家族的成员,可以共刺激T细胞增殖。HVEM是LIGHT介导T细胞活化的受体,LIGHT通过与HVEM结合发挥共刺激作用,参与T细胞增殖和细胞因子的产生。越来越多的证据表明LIGHT与其受体的相互作用可作为控制细胞免疫应答的潜在目标。本研究对小鼠LIGHT作为乙肝核酸疫苗的基因佐剂方面进行了初步研究。在克隆小鼠LIGHT基因的基础上,构建其胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达并对其表达条件进行了初步的探索;构建LIGHT全长基因的真核表达质粒并在体外转染细胞,检测结果表明真核表达质粒中的LIGHT基因可在哺乳动物细胞中进行表达;混合淋巴细胞反应中LIGHT转染的树突状细胞可显着增强同种异体T淋巴细胞增殖;将LIGHT真核表达质粒与乙肝核酸疫苗质粒联合免疫Balb/c小鼠,细胞免疫与体液免疫功能检测结果表明LIGHT可以增强小鼠体内的特异性免疫应答,从而发挥免疫佐剂的作用。
韩新锋[7]（2008）在《串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究》文中研究表明小鹅瘟（Gosling Plague）是严重危害水禽养殖业的重要传染病之一,其防制措施主要依靠疫苗接种,传统疫苗在预防和控制小鹅瘟时,存在着散毒和免疫应答不完全等缺点。基因疫苗符合未来疫苗的发展方向,具有安全和诱导全面的免疫应答等诸多优点。本研究以小鹅瘟病毒（Goose Parvovirus,GPV）VP3为研究对象,构建了VP3单基因DNA疫苗,为了增强VP3基因疫苗的免疫原性,将鹅白介素-2（Goose Interleukin-2,gIL-2）和VP3基因进行串联融合表达,还嵌入了一段CpG免疫刺激序列,将构建的三种基因疫苗分别免疫28日龄雏鹅和种鹅,并对其诱导鹅产生的体液免疫和细胞免疫进行了比较研究,为研制高效小鹅瘟病毒VP3基因疫苗打下了基础。1.为了探索GPV VP3基因构建基因疫苗的可行性,通过PCR扩增和基因重组技术克隆了GPV VP3基因并将其连接到pMD18T-Simple上,在对VP3基因分子特性、遗传特点和抗原性进行了分析之后,亚克隆到pcDNA3.1（+）CMV启动子下游的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了单独表达GPVVP3基因的基因疫苗载体pcDNA-VP3,将其转染真核细胞COS-7后,利用间接免疫荧光抗体试验可以在转染后48h检测到VP3基因的高效表达。2.通过重叠延伸PCR（Splicing by overlap extention PCR）扩增gIL2-VP3串联基因,包含缺失了TAA终止密码子的gIL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP3基因,两个基因之间以高亲水性氨基酸（Gly-Gly-Gly-Ser）编码核苷酸相连接;将gIL2-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到到pcDNA3.1（+）CMV启动子的下游HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了表达gIL2-VP3融合基因的pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。3.人工合成在禽体内具有免疫刺激作用的CpG序列,克隆到pMD18T-Simple载体上,然后亚克隆定向插入到pcDNA-gIL2-VP3目的基因终止密码子后的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,构建成pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗载体,对鹅外周淋巴细胞增殖具有较强的刺激活性（SI=3.06）。4.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg的不同剂量分别免疫28日龄鹅,分别于基因免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d和49d颈静脉采集免疫鹅的抗凝血,分离外周血淋巴细胞后,利用MTT比色法检测ConA对鹅外周血淋巴细胞增殖的免疫刺激作用,发现鹅在免疫pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG后第28d体内细胞免疫最强,200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫组外周血淋巴细胞的ConA刺激指数显着高于pcDNA-gIL2-VP3各组（P＜0.05）;显着高于单基因基因疫苗pcDNA-VP3各个剂量组（P＜0.05）。含有佐剂的pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG两种基因疫苗细胞免疫的峰值比单基因VP3 DNA疫苗提前7d。5.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg不同剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、105d、133d、161d、189d、217d,采用间接ELISA的方法检测鹅体内IgG的动态变化规律,结果显示,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG所诱导的体液免疫水平明显高于pcDNA-VP3单基因组,这两种基因疫苗的各个剂量组均在第35d抗体水平达到最高,其中以200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG的ELISA水平最高,显着区别于pcDNA-VP3各剂量免疫组（P＜0.05）和极显着高于各个对照组（P＜0.01）。从pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG诱导鹅的体液免疫强度和维持时间来看,均优于pcDNA-VP3免疫鹅和GPV弱毒免疫鹅。6.将三种基因疫苗以200μg的剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第15d、30d、45d、60d和75d,采用微量血清中和试验检测基因免疫所诱导的中和抗体水平,结果显示,免疫后第15d就可以检测到中和抗体,鹅血清中和抗体随时间的推移稳定中有所缓慢上升,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫后第60d的鹅血清中和抗体平均效价分别达到峰值1:178.5和1:198.2,二者之间差异不显着,但是显着高于pcDNA-VP3和GPV弱毒免疫鹅（P＜0.05）。7.将三种GPV VP3基因疫苗以200μg的剂量肌肉注射免疫开产前母鹅,分别在免疫后第7d、14d、28d、42d、56d和第70d收集免疫母鹅所产鹅蛋用作卵黄抗体的检测,另外在免疫后第14d、28d、42d取一批鹅蛋入孵用以孵化小鹅用作雏鹅攻毒保护试验。结果显示不同时间卵黄抗体和中和抗体水平与雏鹅攻毒保护率呈现一定的正相关性,三种基因疫苗以pcDNA-gIL2-VP3/CpG效果最好,具有类似于GPV弱毒苗的免疫保护效果。
任晓慧[8]（2007）在《RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨》文中提出本研究采用塞姆利基森林病毒（SFV）RNA复制子和微球（MP）介导基因转移技术,以期提高目的基因的表达水平。首先构建了GHRH和HBsAg-SS单基因以及GHRH-HBsAg-SS双基因RNA复制子真核表达载体,在细胞和小鼠肌肉中成功地表达了目的蛋白,且表达的HBsAg-SS具有反应原性。制备的MP-DNA复合物提高了目的基因的表达以及基因免疫水平;也证实了复制子载体对基因表达具有明显的促进作用,表达水平比普通载体高3倍,诱发抗体水平的升高也显着优于普通载体。微球介导的GHRH和HBsAg-SS基因直接转移,对小鼠和育肥猪均表现出明显的促生长作用。初步探讨了非遗传性获得的促生长机制,证实利用这项技术在大型哺乳动物产生两代间的,非遗传性生物效应的可能性。给妊娠母鼠和母猪进行GHRH和HBsAg-SS基因直接转移,后代表现出明显的促生长作用。同时也证实了GHRH与HBsAg-SS双基因共表达对动物的促生长具有协同作用。本研究为寻求高效的基因表达系统,实现对GH的双向调节,开发新一代提高动物生产性能的长效促生长制剂打下了基础。
管国芳[9]（2006）在《联合应用NDV HN基因、CAV VP3基因及IL-18基因对喉癌细胞的杀伤作用及其体内抑瘤效应研究》文中指出本研究将三个抑瘤机制不同的抗肿瘤基因鸡贫血病毒VP3、新城疫病毒HN及IL-18基因三者联合,分别以真核表达质粒pVAX1及鸡痘病毒FPV为载体,构建了含有上述三种基因的真核重组质粒pVVP3IL-18HN及重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN,并对两者进行了体内外抑瘤实验的研究,观察了三种基因的协同抑瘤作用,为在一个载体内实现联合基因治疗奠定了基础。首先将真核重组质粒pVVP3IL-18HN转染人喉癌Hep-2细胞,通过RT-PCR、western-blot法及间接免疫荧光分析表明,外源基因VP3基因及IL-18HN嵌合基因在Hep-2细胞中获得了正确的表达;采用MTT法、吖锭橙/溴化乙锭染色、电子显微镜超薄切片、基因组DNA电泳、流式细胞仪结合DCFA染色、罗丹明123染色、MHC-I分子表达检测等方法观察了pVVP3IL-18HN对Hep-2肿瘤细胞的体外杀伤作用及其作用机制,实验结果显示,该重组质粒对Hep-2细胞具有明显的杀伤作用,作用最终将导致肿瘤细胞凋亡,推测其所诱导的细胞凋亡可能是通过线粒体途径发生的;另外,pVVP3IL-18HN还上调了肿瘤细胞表面MHC-I分子的表达,提高了肿瘤细胞的免疫原性。其次本研究还建立了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,观察了pVVP3IL-18HN的体内抑瘤效应;通过对抑瘤率、小鼠脾细胞淋巴细胞亚群分类及特异性细胞毒CTL活性的检测,比较了单基因疫苗与联合基因疫苗的体内抑瘤效果及其对机体的免疫刺激作用,结果表明:联合基因疫苗pVVP3IL-18HN的抑瘤率及对机体抗肿瘤主动免疫的诱导作用明显高于上述基因的单基因疫苗pVVP3、pVIL-18及pVHN,说明克隆在同一载体上的鸡贫血病毒VP3基因、IL-18基因和HN基因在动物体内应用可产生协同的抗肿瘤效应。本研究通过同源重组成功的筛选出了一株具有良好遗传稳定性的重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN。运用Southern blot、Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光等方法检测外源基因重组情况及重组鸡痘病毒在鸡胚成纤维细胞内的表达。实验结果证明,外源基因已重组入鸡痘病毒基因组中,且可在鸡胚成纤维细胞内有效表达。采用MTT法、吖锭橙/溴化乙锭染色、基因组DNA电泳、流式细胞仪检测细胞内活性氧水平、线粒体膜电位及MHC-I分子的表达等方法观察并比较了含三基因的重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN与含单基因的重组鸡痘病毒vFVVP3、vFVHN对Hep-2肿瘤细胞的体外杀伤作用及其对肿瘤细胞免疫原性的影响。实验结果证明,三联重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN在体外对肿瘤细胞的抑制作用及对肿瘤细胞免疫原性的增强作用要明显强于单基因的重组鸡痘病毒vFVVP3及vFVHN,说明三联重组鸡痘病毒载体中携带的的三个抑癌基因发挥了协同抑瘤作用;另外,对其作用机制的研究表明,重组鸡痘病毒的感染最终导致肿瘤细胞凋亡,推测重组鸡痘病毒所诱导的细胞凋亡路径可能是线粒体途径。此外,我们还借鉴了prime-boost的加强免疫策略,建立了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,利用本研究所构建的携有相同基因的两种不同载体抗肿瘤三基因疫苗rDNA和rFPV,分别以不同免疫策略,进行了荷瘤小鼠基因免疫治疗的实验研究,通过对基因免疫治疗小鼠脾CD4+、CD8+ T细胞亚群的数量、脾细胞特异性CTL杀伤活性及抑瘤率的检测,探讨应用不同载体的两种疫苗以不同方式进行联合免疫,对以上两种疫苗免疫应答及抑瘤效果的影响。结果表明,应用prime-boost联合免疫组小鼠的细胞免疫应答水平及抑瘤效果均明显高于2个单独免疫组,证实了rDNA+rFPV,即以治疗性rDNA疫苗进行基础免疫,以rFPV疫苗进行加强免疫的Prime-Boost加强免疫治疗策略能诱导荷瘤小鼠机体产生更强大的特异性抗肿瘤主动免疫,对肿瘤细胞的杀伤作用最大。而与此对应的,rFPV+rDNA联合免疫策略总体效果则与单一疫苗的水平相当。从而提示我们,合适的联合免疫方案对免疫效果的提升具有重要的作用。
罗满生[10]（2006）在《CpG寡核苷酸增强重组HBsAg疫苗免疫应答的实验研究》文中提出目的通过一些体内和体外试验证实,来自细菌或人工合成的非甲基化的CpG寡核苷酸（ODN）能诱导免疫淋巴细胞增殖及免疫球蛋白、单核细胞因子、INF-γ等的分泌,并能激活自然杀伤细胞的溶细胞效应。CpG ODN的这些功能意味它可能在增强机体对疫苗的免疫应答方面具有一定的前景。现有的HBsAg重组蛋白疫苗虽说在一定程度上能起到较好的作用,但一些调查统计表明,在经过此种疫苗接种的人群中,约有10%15%的免疫人群并未产生较理想的免疫效果。正因为如此,许多研究人员正试图从新型免疫佐剂的开发这一方向寻找克服这个缺点的新型疫苗。本实验就是围绕这一主题试图通过CpG寡核苷酸（CpG ODN）与乙型肝炎病毒重组蛋白疫苗联合免疫C57BL/6小鼠,观察它对小鼠免疫状况的影响。进而探讨CpG寡核苷酸（CpG ODN）能否作为一种佐剂与HBsAg疫苗一起,更好地刺激机体免疫系统产生有效的应答。方法将小鼠分为三组,第一组为生理盐水对照,第二组为乙型肝炎病毒重组蛋白疫苗接种,第三组为CpG ODN与重组HBsAg疫苗联合接种,按照第1天、第15天、第22天的程序进行免疫接种,于免疫后第29天分别采血1.0ml,并处死小鼠迅速制备脾细胞悬液。用MTT法分别进行HBsAg蛋白特异性刺激的淋巴细胞转化试验、HBsAg蛋白特异性刺激的细胞毒性T细胞杀伤试验(HBsAg specific
二、携带免疫刺激DNA序列的载体及人工合成免疫刺激DNA对HBV核心区基因免疫的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、携带免疫刺激DNA序列的载体及人工合成免疫刺激DNA对HBV核心区基因免疫的影响（论文提纲范文）
（1）基于RNAi和CRISPR/Cas技术复合系统的抗HBV作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、文献综述 基因编辑技术抗 HBV 作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 二、在学期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简介 |
（2）核酸无膜细胞器的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 1 核酸纳米结构 |
| 1.1 DNA纳米结构 |
| 1.2 RNA纳米结构 |
| 2 无膜细胞器 |
| 2.1 无膜细胞器的形成研究 |
| 2.2 无膜细胞器的生物作用研究 |
| 2.3 无膜细胞器的体外研究 |
| 3 核酸纳米结构和核酸无膜细胞器共同发展 |
| 3.1 核酸纳米结构和核酸无膜细胞器共同点 |
| 3.2 核酸纳米结构和核酸无膜细胞器领域相互促进 |
| 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第一章 DNA无膜细胞器的设计、组装及表征 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA无膜细胞器序列设计 |
| 2.2 DNAμPs组装过程的模拟 |
| 2.3 变性PAGE实验检测DNA纯度 |
| 2.4 DNAμPs的组装 |
| 2.5 DNAμPs的表征 |
| 2.6 离心分离法半定量分析DNAμPs的产率 |
| 2.7 具尾DNAμPs的组装 |
| 2.8 具尾DNAμPs的表征 |
| 2.9 DNA浓度和镁离子浓度对具尾DNAμPs组装的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 两组多回文结构域ssDNA的纯度验证 |
| 3.2 DNAμPs的表征 |
| 3.3 离心分离法半定量分析DNAμPs的产率 |
| 3.4 具尾DNAμPs的表征 |
| 3.5 离心分离法半定量分析具尾DNAμPs产率 |
| 3.6 DNA浓度及镁离子浓度可影响具尾DNAμPs的组装 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 第二章 DNA无膜细胞器对巨噬细胞免疫刺激作用及单链DNA的捕获作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 序列设计 |
| 2.2 CpG–DNAμPs刺激免疫反应过程 |
| 2.3 CpG–DNAμPs对巨噬细胞免疫刺激作用初步研究 |
| 2.4 具尾DNAμPs对 ssDNA的捕获作用 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CpG–DNAμPs可刺激RAW264.7 巨噬细胞分泌免疫因子,增强免疫反应 |
| 3.2 CpG–DNAμPs不影响RAW264.7 巨噬细胞存活率 |
| 3.3 具尾DNAμPs可捕获ssDNA |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 第三章 DNA无膜细胞器捕获癌细胞中致癌miR–21,从而致死癌细胞的作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验主要试剂 |
| 1.3 实验细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA序列设计 |
| 2.2 DNAμP21 捕获致癌miR–21,致死癌细胞的过程 |
| 2.3 变性PAGE实验验证各条ssDNA和 miR–21 的纯度 |
| 2.4 DNAμP21的组装 |
| 2.5 LSCM观察DNAμP21 形态 |
| 2.6 非变性PAGE实验分析1 P21和21–1 P结构 |
| 2.7 非变性PAGE实验考察DNAμP21对miR–21 的捕获作用 |
| 2.8 细胞复苏和培养 |
| 2.9 DNAμP21 进入MCF–7 乳腺癌细胞的能力研究 |
| 2.10 QPCR检测DNAμP21对MCF–7 乳腺癌细胞中miR–21 水平的调节作用 |
| 2.11 DNAμP21对MCF–7 乳腺癌细胞的致死作用研究 |
| 2.12 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 各ssDNA和 miRNA纯度验证 |
| 3.2 LSCM实验观察DNAμP21 形态 |
| 3.3 1P21和21–1P可形成二聚体结构 |
| 3.4 DNAμP21 可进入MCF–7 乳腺癌细胞 |
| 3.5 DNAμP21 可在体外捕获miR–21 |
| 3.6 DNAμP21 可下调MCF–7 乳腺癌细胞中miR–21 水平 |
| 3.7 DNAμP21 可致死MCF–7 乳腺癌细胞 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 第四章 RNA无膜细胞器的设计、组装及表征 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA无膜细胞器的序列设计 |
| 2.2 RNA体外转录 |
| 2.3 RNA纯度验证 |
| 2.4 不同退火程序及镁离子浓度对RNAμAs组装的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 成功转录得到不同回文结构域数目的RNA |
| 3.2 不同退火程序及镁离子浓度可以影响RNAμAs的组装 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 第五章 RNA无膜细胞器的基因沉默作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验主要试剂 |
| 1.3 蛋白免疫印迹实验相关试剂配制 |
| 1.4 其余实验溶液的配制 |
| 1.5 实验细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNAμAs在细胞核内、转录后水平沉默目的基因的原理 |
| 2.2 RNAμAs对 GFP mRNA在凝胶中迁移率的影响 |
| 2.3 RNAμAs在 Hela细胞中对GFP表达的抑制作用观察 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNAμAs可阻碍GFP mRNA在凝胶中的迁移率 |
| 3.2 RNAμAs在 Hela细胞中可抑制GFP的表达,且对细胞正常功能无影响 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点与意义 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间科研工作汇报 |
（3）基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB概述 |
| 1.1.1 NF-κB介绍 |
| 1.1.2 NF-κB与癌症 |
| 1.2 启动子改造及人工合成启动子 |
| 1.2.1 真核启动子改造 |
| 1.2.2 人工合成启动子 |
| 1.2.3 CMV启动子简介 |
| 1.3 肿瘤治疗 |
| 1.3.1 肿瘤的基因治疗 |
| 1.3.2 肿瘤的免疫治疗 |
| 1.3.3 rAAV病毒载体 |
| 1.4 研究内容和意义 |
| 第二章 基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料及仪器 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 启动子的改造 |
| 2.2.4 质粒的构建 |
| 2.2.5 用细胞内表达报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.6 用单分泌报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.7 用双分泌报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.8 用EGFP报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.9 评估NF-κB对启动子活性的影响 |
| 2.2.10 启动子应用于分泌型hG-CSF蛋白的表达 |
| 2.2.11 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 HepG2和CHO细胞中突变启动子的初步改造与活性检测 |
| 2.3.2 HepG2和CHO细胞中突变启动子的深入改造和活性检测 |
| 2.3.3 用EGFP报告基因检测启动子活性 |
| 2.3.4 检测启动子的NF-κB特异性调控 |
| 2.3.5 多种细胞检测优化启动子的表达效果 |
| 2.3.6 改造启动子应用于分泌型hG-CSF蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂材料及仪器 |
| 3.2.2 细胞培养和转染 |
| 3.2.3 NF-κB特异性启动子表达检测 |
| 3.2.4 NF-κB特异性表达系统报告基因质粒构建 |
| 3.2.5 NF-κB靶向性miRNA表达质粒构建和筛选检测 |
| 3.2.6 构建并评估NF-κB自调控miRNA表达载体 |
| 3.2.7 荧光定量检测RelA及其靶基因的表达 |
| 3.2.8 自调控系统对细胞活力影响检测 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NF-κB特异性启动子表达效果检测 |
| 3.3.2 DMP-amiRNA原理示意图 |
| 3.3.3 靶向于NF-κB的miRNA筛选检测 |
| 3.3.4 DMP-miRNA抑制NF-κB活性效果检测 |
| 3.3.5 DMP-amiRNA对RelA及其靶基因的调控效果检测 |
| 3.3.6 DMP-amiRNA系统对细胞活力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因载体构建及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂材料及仪器 |
| 4.2.2 细胞培养及转染 |
| 4.2.3 质粒构建 |
| 4.2.4 分析NF-κB RelA/p65 在多个细胞中的表达水平 |
| 4.2.5 使用EGFP报告基因评估表达载体 |
| 4.2.6 使用SBP报告基因评估表达载体 |
| 4.2.7 重组AAV病毒的制备 |
| 4.2.8 重组病毒在细胞中的表达检测 |
| 4.2.9 评估重组病毒的抗肿瘤功能 |
| 4.2.10 用qPCR检测病毒分布和抗原基因表达 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NF-κB依赖性肿瘤免疫疗法原理 |
| 4.3.2 NF-κB RelA/p65 在各种细胞中的表达 |
| 4.3.3 使用EGFP报告基因检测表达载体 |
| 4.3.4 使用SBP作为报告基因检测表达载体 |
| 4.3.5 重组病毒载体的构建及表达检测 |
| 4.3.6 DMP活性基因表达系统在体内的癌症治疗 |
| 4.3.7 检测小鼠不同组织中病毒分布和抗原基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（4）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（5）禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 选题背景 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 3.多表位DNA疫苗的研究概况 |
| 4.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 5.细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 本研究前期工作基础 |
| 存在的问题 |
| 本研究的内容及目的意义 |
| 本研究的技术路线 |
| 第一章 禽传染性支气管炎病毒S1、S2、N蛋白抗原表位预测筛选及多表位嵌合基因克隆 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 数据库、生物信息学软件 |
| 2.1.2 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.3 工具酶及试剂及主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的预测分析 |
| 2.2.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的确定 |
| 2.2.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因的获取 |
| 2.2.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接 |
| 2.2.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的克隆及鉴定 |
| 2.2.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV S1、S2、N蛋白B细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.2 IBV S1、S2、N蛋白T细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因片段的选择及合成 |
| 3.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接结果 |
| 3.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的鉴定结果 |
| 3.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的结构特征分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于IBV的免疫机理 |
| 4.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的分析及选择 |
| 4.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位的获取及嵌合基因的拼接 |
| 4.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的构建策略 |
| 4.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学特征 |
| 5.小结 |
| 第二章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因原核表达及ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 IBV多表位嵌合基因的原核诱导表达 |
| 2.2.3 IBV多表位嵌合基因原核表达产物的鉴定 |
| 2.2.4 IBV多表位嵌合基因原核表达条件的优化 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体pET-32a-F的鉴定 |
| 3.2 IBV多表位嵌合基因表达产物的SDS-PAGE及Western blots |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因原核表达诱导时间、浓度、温度的筛选 |
| 3.4 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布及纯化 |
| 3.5 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 4.讨论 |
| 4.1 IBV多表位嵌合蛋白的表达系统 |
| 4.2 IBV多表位嵌合蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 IBV多表位嵌合蛋白的回收及活性 |
| 4.4 关于IBV多表位嵌合蛋白的间接ELISA方法 |
| 5.小结 |
| 第三章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗构建及真核表达检测 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 鸡白介素IL-1β/2/18真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒的鉴定 |
| 3.2 pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-18质粒的鉴定 |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因及鸡白介素真核表达转录产物RT-PCR检测 |
| 3.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒表达产物的间接免疫荧光检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于多表位DNA疫苗 |
| 4.2 不同载体于体外表达IBV多表位嵌合基因 |
| 4.3 关于IBV多表位嵌合基因真核表达质粒的体外转染 |
| 4.4 影响外源基因表达的因素 |
| 4.5 IBV结构蛋白多表位嵌合基因的体外表达的检测 |
| 5.小结 |
| 第四章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗配制和免疫研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备、转染效率的检测 |
| 2.2.3 DNA疫苗的配制 |
| 2.2.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F、pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗免疫组的攻毒保护性实验 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.2 脂质体的转染效率检测 |
| 3.3 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.3.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.4 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.4.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.5 攻毒实验结果 |
| 3.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 DNA疫苗的配制和免疫 |
| 4.2 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.3 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.4 关于攻毒保护性试验 |
| 4.5 关于DNA疫苗的分布和整合可能性 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展 |
| 3.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 4.多表位疫苗的研究概况 |
| 5.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 6.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 |
| 7.DNA疫苗的组织分布 |
| 8.DNA疫苗的整合可能性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:英汉缩略名词对照表 |
| 在读博士期间发表的论文情况 |
（6）小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、核酸疫苗 |
| 二、乙肝核酸疫苗 |
| 三、基因佐剂 |
| 四、LIGHT |
| 实验一 小鼠LIGHT基因的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二 LIGHT在真核细胞中的表达及功能检测 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 乙肝核酸疫苗与LIGHT真核表达质粒的联合免疫研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
（7）串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 本文创新性研究工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 小鹅瘟的研究进展 |
| 1 小鹅瘟病毒的病原学特征 |
| 1.1 小鹅瘟病毒的理化特征 |
| 1.2 小鹅瘟病毒的宿主范围和培养特性 |
| 1.3 基因组分子生物学 |
| 1.4 蛋白质分子生物学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状和病理变化 |
| 3.1 肠道变化 |
| 3.2 其他组织器官的变化 |
| 4 小鹅瘟诊断方法 |
| 5 小鹅瘟病毒的基因克隆以及体外编码蛋白的研究 |
| 6 综合防制 |
| 7 研究展望 |
| 第二章 增强基因疫苗免疫效果的策略 |
| 1 基因疫苗的免疫学优势和所存在的问题 |
| 1.1 基因疫苗的免疫学优势 |
| 1.1.1 诱导全方位的免疫应答 |
| 1.1.2 不同血清亚型的交叉免疫 |
| 1.1.3 嵌合免疫、多重免疫及联合免疫 |
| 1.1.4 长期免疫 |
| 1.1.5 性质稳定,安全性好,受母源抗体影响小 |
| 1.2 制约基因疫苗免疫效果的因素 |
| 1.2.1 依赖宿主产生抗原 |
| 1.2.2 宿主细胞内外屏障 |
| 1.2.3 抗原表达量低 |
| 2 增强基因疫苗免疫效果的一些策略 |
| 2.1 基因疫苗质粒的优化 |
| 2.1.1 选择强的转录启动子 |
| 2.1.2 注意密码子的偏嗜 |
| 2.1.3 构建双向或双顺反子质粒 |
| 2.1.4 载体中的免疫刺激性序列(ISS) |
| 2.1.5 其它元件 |
| 2.2 免疫接种系统和途径的选择 |
| 2.2.1 接种方法 |
| 2.2.2 接种途径 |
| 2.2.3 免疫动物的预处理 |
| 2.3 克服细胞内、外屏障 |
| 2.3.1 使用脂质体、亚精胺和核酸酶抑制剂 |
| 2.3.2 抗原蛋白的泛素化表达 |
| 2.3.3 内质网转运信号序列 |
| 2.3.4 基因疫苗的细菌传送系统 |
| 2.4 优化免疫应答趋向类型 |
| 2.4.1 和细胞因子共表达 |
| 2.4.2 共刺激信号分子 |
| 2.4.3 初次免疫和加强免疫使用相同抗原的不同类型的疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 小鹅瘟病毒VP3基因的克隆和分子特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒及核酸 |
| 1.2 试验动物和鹅胚 |
| 1.3 质粒与感受态细胞 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 GPV CHv-1强毒株的增殖 |
| 2.2 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 VP3基因的PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的凝胶试剂盒回收和纯化 |
| 2.6 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 |
| 2.7 VP3基因加A尾以及与T载体的连接 |
| 2.8 重组质粒的转化 |
| 2.9 碱裂解法小量抽提重组质粒 |
| 2.10 重组质粒的酶切鉴定及PCR鉴定 |
| 2.11 VP3基因序列测定 |
| 2.12 VP3基因及推导蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR结果 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 CHv-1株VP3基因测序结果及其与标准株的比较分析 |
| 3.4 GPV VP3基因的遗传特点 |
| 3.5 GPV CHv-1 VP3基因推导蛋白质二级结构预测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于GPV VP3基因的PCR扩增 |
| 4.2 GPV CHv-1株VP3基因的序列测定和结果分析 |
| 4.3 GPV VP3基因用于构建基因疫苗的可行性 |
| 5 小结 |
| 第四章 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其在真核细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 毒株、细胞及鸭胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 T载体的酶切和VP3基因片段的纯化回收 |
| 2.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切和线性化 |
| 2.3 VP3基因回收片段和线性化pcDNA3.1(+)的连接(亚克隆) |
| 2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.5 真核重组表达载体的转化 |
| 2.6 阳性重组真核表达质粒的小量抽提和鉴定 |
| 2.7 GPV病毒提纯及兔抗GPV多克隆抗体的制备 |
| 2.8 pcDNA-VP3转染COS-7真核细胞 |
| 2.9 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-VP3在真核细胞的瞬时表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 VP3基因的亚克隆 |
| 3.2 兔抗GPV IgG的纯化结果 |
| 3.3 真核表达质粒在COS-7细胞上的瞬时表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 构建小鹅瘟基因疫苗的必要性 |
| 4.2 构建基因疫苗的一些影响因素 |
| 4.3 GPV VP3基因疫苗在真核细胞的表达 |
| 5 小结 |
| 第五章 串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3融合基因DNA疫苗的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重叠延伸引物的设计 |
| 2.2 碱裂解法小量抽提pMD18T-gIL2和pMD18T-VP3 |
| 2.3 gIL-2基因的PCR扩增 |
| 2.4 VP3基因的PCR扩增 |
| 2.5 gIL-2和VP3基因PCR产物的回收和纯化 |
| 2.6 gIL2-VP3融合基因的SOE PCR扩增 |
| 2.7 融合基因PCR产物的纯化和回收 |
| 2.8 克隆至pMD18T-Simple载体和转化受体菌 |
| 2.9 融合基因gIL2-VP3的亚克隆 |
| 2.10 融合基因真核表达载体的鉴定 |
| 2.11 融合蛋白的生物信息学分析 |
| 2.12 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞上的表达 |
| 2.13 pcDNA-gIL2-VP3表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 gIL2-Linker的初次PCR结果 |
| 3.2 GPV的Linker-VP3初次PCR结果 |
| 3.3 gIL2-VP3融合基因的PCR结果 |
| 3.4 融合基因的T载体克隆和测序结果 |
| 3.5 pcDNA-gIL2-VP3真核表达载体的构建结果 |
| 3.6 gIL2-VP3融合基因的生物信息学分析 |
| 3.7 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞中的表达 |
| 3.8 表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于鹅白介素-2(gIL-2)的佐剂效应 |
| 4.2 关于重叠延伸PCR |
| 4.3 融合基因gIL2-VP3的分子结构特点 |
| 4.4 gIL-2信号肽引导的分泌表达 |
| 5 小结 |
| 第六章 CpG序列嵌入串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗中的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CpG的合成及T载体克隆 |
| 2.2 pMD18 T-CpG的酶切和回收 |
| 2.3 pcDNA-gIL2-VP3的酶切和回收 |
| 2.4 CpG和线性pcDNA-gIL2-VP3的连接 |
| 2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 pcDNA-gIL2-VP3/CpG重组质粒的筛选 |
| 2.8 pcDNA-gIL2-VP3/CpG真核表达质粒在真核细胞的表达 |
| 2.9 pcDNA-gIL2-VP3/CpG对鹅外周血淋巴细胞的免疫刺激作用 |
| 3 结果 |
| 3.1 pMD18 T-CpG的测序结果 |
| 3.2 pMD18T-CpG的酶切鉴定 |
| 3.3 pcDNA-gIL2-VP3/CpG的构建及其鉴定 |
| 3.4 间接免疫荧光抗体试验检测pcDNA-gIL2-VP3/CpG在真核细胞的表达 |
| 3.5 CpG序列对鹅外周血淋巴细胞的增殖效应 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于CpG ODN的设计和嵌入质粒的构建 |
| 4.2 CpG序列的免疫佐剂效应 |
| 5 小结 |
| 第七章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅细胞免疫的比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因疫苗的大量制备 |
| 2.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗质粒 |
| 2.3 雏鹅的分组免疫及血样采集 |
| 2.4 鹅外周血(PBMC)淋巴细胞增殖试验(MTT法) |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 样品检测及数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因疫苗免疫动物后健康状况 |
| 3.2 鹅免疫GPV VP3基因疫苗后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.3 pcDNA-VP3基因疫苗免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.4 pcDNA-gIL2-VP3免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5 pcDNA-gIL2-VP2/CpG免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.6 GPV VP3基因疫苗免疫鹅后外周淋巴血细胞增殖试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞免疫对于防治感染性疾病的重要性 |
| 4.2 细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.3 分子免疫佐剂对基因疫苗诱导的细胞免疫反应的影响 |
| 4.4 免疫途径、剂量对细胞免疫的影响 |
| 5 小结 |
| 第八章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅体液免疫的比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、质粒及疫苗 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鹅血清IgG的纯化 |
| 2.2 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.3 间接ELISA的操作方法 |
| 2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 2.6 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清IgG水平的检测 |
| 2.7 GPV CHa弱毒株TCID_(50)的测定 |
| 2.8 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清中和抗体水平的检测 |
| 2.9 种鹅的分组免疫及所产蛋卵黄ELISA抗体和中和抗体的检测 |
| 2.10 免疫种鹅所产蛋孵出的小鹅攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔抗鹅HRP酶标抗体的制备 |
| 3.2 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.3 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 3.4 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后的IgG动态变化结果 |
| 3.5 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-VP3后IgG动态变化 |
| 3.6 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗后IgG动态变化 |
| 3.7 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗后IgG动态变化 |
| 3.8 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后IgG动态变化结果 |
| 3.9 病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.10 鹅基因免疫后血清中和抗体试验检测结果 |
| 3.11 母鹅卵黄抗体ELISA检测结果和中和抗体试验结果 |
| 3.12 雏鹅攻毒保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ELISA标准方法的建立 |
| 4.2 关于GPV VP3基因疫苗诱导的体液免疫 |
| 4.3 免疫佐剂对体液免疫的影响 |
| 4.4 雏鹅攻毒保护试验 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 附件材料 |
| 附录一 主要溶液试剂的配制 |
| 附录二 雏鹅攻毒保护试验中发病鹅的主要临床症状和病变 |
| 附录三 测序报告 |
| 1.pMD18T-VP3测序结果 |
| 2.pMD18T-gIL2-VP3测序结果 |
| 3.pMD18T-CpG测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 甲病毒载体系统的研究进展 |
| 1 甲病毒简介 |
| 2 甲病毒复制子载体发展历程 |
| 3 甲病毒复制子结构以及递送方式 |
| 4 甲病毒复制子载体种类 |
| 5 甲病毒复制子载体应用 |
| 6 甲病毒复制子载体的生物安全性问题 |
| 第二章 生长激素释放因子和生长激素释放抑制因子 |
| 1 GHRH、SS 与GH/IGF-I 生长轴的关系 |
| 2 GHRH 概述 |
| 3 SS 概述 |
| 4 GHRH 和SS 共同协调控制GH 的分泌模式 |
| 5 GHRH 在动物生产中的应用研究 |
| 6 SS 在动物生产中的应用研究 |
| 7 GHRH 和SS 基因转移的新方法：PLGA-MP |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 GHRH、SS 及GHRH-SS RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GHRH 基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 2.2 HBSAG-SS 基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 2.3 GHRH-HBSAG-SS 双基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 GHRH、SS 及GHRH-SS RNA 复制子表达载体在真核细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 总RNA 的提取 |
| 2.2 转染细胞的RT-PCR |
| 2.3 TRICINE-SDS-PAGE 和SDS-PAGE 结果 |
| 2.4 表达产物的DOT-ELISA（检测表达的SS 和GHRH） |
| 2.5 WESTERN BLOT 检测结果（检测表达的HBSAG、SS、 |
| 2.6 细胞原位免疫荧光结果 |
| 2.7 双抗体夹心ELISA 法检测细胞表达的HBSAG |
| 2.8 放免法检测转染细胞表达的GHRH 和SS |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 RNA 复制子载体与普通载体表达水平比较的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PIRES-LACZ 载体的构建 |
| 2.2 LACZ 基因在293 和BHK-21 细胞中表达 |
| 2.3 LACZ 基因小鼠肌肉中的表达水平 |
| 2.4 GHRH 基因在293 和BHK-21 细胞中的表达 |
| 2.5 GHRH 基因在小鼠肌肉中的表达 |
| 2.6 HBSAG-SS 基因在293 和BHK-21 细胞的表达 |
| 2.7 HBSAG-SS 基因在小鼠肌肉中的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 RNA 复制子载体与普通载体基因表达水平的比较 |
| 3.2 甲病毒RNA 复制子载体的生物安全性问题 |
| 4 小结 |
| 第四章 微球介导GHRH、SS 和GHRH-SS RNA 复制子表达载体在小鼠体内的表达及对生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PLGA-MP 的制备以及性质考察 |
| 2.2 微球介导GHRH、HBSAG 和SS 基因在小鼠肌肉内的表达 |
| 2.3 微球介导GHRH 和SS 及双基因的RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对小鼠生长的影响 |
| 2.4 微球介导 HBsAg 和 SS RNA 复制子表达质粒基因免疫小鼠试验 |
| 2.5 微球介导GHRH 和SS 及双基因的RNA 复制子表达质粒在妊娠母鼠肌肉组织的表达对子代小鼠生长的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PLGA-MP-DNA 的制备方法和性质 |
| 3.2 影响PLGA-MP 质量的因素 |
| 3.3 PLGA-MP 的安全性 |
| 3.4 PLGA-MP-DNA 对基因表达和免疫效果的影响 |
| 3.5 RNA 复制子对SS 融合基因的免疫效果和促生长作用的影响.. |
| 3.6 微球介导GHRH 和SS 基因的RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对小鼠生长的影响 |
| 3.7 GHRH 和SS 基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母鼠肌肉组织的表达对子代小鼠生长的影响 |
| 3.8 GHRH 和HBSAG-SS 双基因共表达对小鼠促生长的协同作用 |
| 4 小结 |
| 第五章 微球介导GHRH、SS 和GHRH-SS RNA 复制子表达载体在猪体内的表达及对生长和免疫机能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 微球介导HBSAG-SS基因RNA复制子表达质粒在肌肉组织的表达对育肥猪生长及免疫机能的影响 |
| 2.2 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因以及双基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母猪肌肉组织的表达对后代仔猪生长及免疫机能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SS 基因主动免疫的效果及其对育肥猪生长的影响 |
| 3.2 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母猪肌肉组织的表达对后代仔猪生长的影响 |
| 3.3 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对猪免疫机能的影响 |
| 3.4 微球介导GHRH-HBSAG-SS双基因RNA复制子表达质粒在肌肉组织的共表达对猪生长和免疫的协同作用 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（9）联合应用NDV HN基因、CAV VP3基因及IL-18基因对喉癌细胞的杀伤作用及其体内抑瘤效应研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 肿瘤基因治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡贫血病毒 VP3 基因抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 第三章 新城疫病毒抗肿瘤作用及其机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 pVVP3IL-18HN 真核重组质粒的构建及在 Hep-2 细胞中的表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 pVVP3IL-18HN 对 Hep-2 细胞杀伤作用及其体内抑瘤效应的研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 vFVVP3IL-18HN 重组鸡豆病毒的构建及筛选 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 vFVVP3IL-18HN 对 Hep-2 细胞体外抑瘤作用及分子机制的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 vFVVP3IL-18HN 体内抑瘤实验及其加强免疫策略的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表文章及科研情况 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
（10）CpG寡核苷酸增强重组HBsAg疫苗免疫应答的实验研究（论文提纲范文）
| 一、论文 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| (三) 前言 |
| (四) 材料与方法 |
| (五) 结果 |
| (六) 讨论 |
| (七) 结论 |
| (八) 致谢 |
| (九) 参考文献 |
| 二、文献综述 |
| (一) 正文 |
| (二) 参考文献 |
| 学位论文版权使用授权书 |
四、携带免疫刺激DNA序列的载体及人工合成免疫刺激DNA对HBV核心区基因免疫的影响（论文参考文献）
- [1]基于RNAi和CRISPR/Cas技术复合系统的抗HBV作用及其机制研究[D]. 兰婷钰. 锦州医科大学, 2021(01)
- [2]核酸无膜细胞器的研究[D]. 曾杰. 西南大学, 2020(01)
- [3]基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究[D]. 王丹阳. 东南大学, 2018(03)
- [4]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [5]禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究[D]. 田浪. 四川农业大学, 2009(07)
- [6]小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究[D]. 张亚丽. 华东师范大学, 2008(11)
- [7]串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究[D]. 韩新锋. 四川农业大学, 2008(01)
- [8]RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨[D]. 任晓慧. 吉林大学, 2007(03)
- [9]联合应用NDV HN基因、CAV VP3基因及IL-18基因对喉癌细胞的杀伤作用及其体内抑瘤效应研究[D]. 管国芳. 吉林大学, 2006(09)
- [10]CpG寡核苷酸增强重组HBsAg疫苗免疫应答的实验研究[D]. 罗满生. 大连医科大学, 2006(11)