一、抗人脑胶质瘤单克隆抗体H_(12)的荧光标记（论文文献综述）
赵峰[1]（2021）在《改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型及隐丹参酮治疗脑瘤的研究》文中指出第一部分改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型目的:建立桡足类超绿色荧光蛋白（cop GFP）与纳米荧光素酶（Nluc）标记的MHCC97-H人肝癌细胞株,通过改进型颈动脉注射法构建应用小动物活体成像系统观察的裸鼠脑转移瘤模型。方法:使用携带目的基因的慢病毒载体质粒通过磷酸钙法转染293FT细胞,包装慢病毒后感染MHCC97-H细胞,经嘌呤霉素筛选感染阳性细胞,通过有限稀释法纯化得到稳定表达cop GFP及Nluc的单克隆细胞株。体外对比稳定转染细胞株与原始株的增殖、迁移和侵袭等肿瘤细胞表型。通过改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移模型,应用活体成像系统监测颅内转移灶生长情况。结果:成功建立了cop GFP与Nluc标记的MHCC97-H人肝癌细胞稳定转染细胞株;稳定转染株细胞的增殖、迁移和侵袭能力与原始株相比无显着统计学差异（P>0.05）;分别使用稳定转染株与原始株细胞通过改进型颈动脉注射法造模,两组荷瘤裸鼠体质量变化及生存曲线无显着统计学差异（P>0.05）,使用稳定转染株造模裸鼠可通过活体成像系统实时监测到脑转移的形成,所检测生物发光信号强度随肿瘤生长而逐渐增强。结论:经cop GFP与Nluc双荧光标记的MHCC97-H人肝癌细胞通过改进型颈动脉注射法成功构建裸鼠脑转移模型,可通过活体成像系统进行无创、连续可视化监测,为肝癌脑转移机制的研究及治疗药物的研发提供了理想的动物模型。第二部分隐丹参酮治疗脑瘤的研究目的:研究隐丹参酮与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）联合应用对胶质瘤U87细胞凋亡的影响并探讨其相关作用机制。方法:恶性神经胶质瘤U87细胞体外培养,隐丹参酮单独以不同时间、不同浓度处理,Western blot法检测死亡受体DR4、DR5、STAT3表达及p-STAT3（Tyr705）修饰水平变化。设置对照组、隐丹参酮组、TRAIL组及隐丹参酮与TRAIL联用组,MTT法检测各组对U87细胞存活率的影响;DAPI染色和Annexin V/PI双染法流式细胞术检测各组对U87细胞凋亡的影响;Western blot法检测各组caspase家族蛋白表达及信号通路STAT3、p-STAT3（Tyr705）表达。结果:隐丹参酮呈时间及剂量依赖的方式提高U87细胞中DR4和DR5的表达、抑制STAT3（Tyr705）磷酸化修饰;隐丹参酮与TRAIL联用显着抑制U87细胞活力（P<0.01）并且促进细胞凋亡率（P<0.01）;联合用药组显着促进了caspase家族蛋白表达,抑制了STAT3（Tyr705）磷酸化修饰（均P<0.05）,并且两者联合应用的效果优于隐丹参酮或TRAIL的单独应用（P<0.05）。结论:隐丹参酮联用TRAIL可协同抑制胶质瘤U87细胞增殖及促进细胞凋亡,其作用机制可能与隐丹参酮上调DR4、DR5的表达及其对STAT3通路的抑制作用有关。
赵鹏飞[2]（2021）在《紫草素/双硫仑仿生递药系统的构建及脑胶质瘤治疗的研究》文中研究指明肿瘤代谢与微环境之间的互动是影响脑胶质瘤进程的重要因素。肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment,TIME）中包含基质细胞、成纤维细胞、免疫细胞等多种成分,且处于有利于肿瘤发展的免疫抑制状态。肿瘤细胞主要通过糖酵解的代谢模式供能,伴随免疫抑制代谢物（如:乳酸等）的产生,进一步有利于免疫抑制环境的形成,加速肿瘤的生长。许多化疗药物可以诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）,产生特异性的肿瘤新抗原,激活局部免疫,从而特异性杀伤肿瘤细胞实现免疫治疗。因此,通过调控肿瘤细胞代谢和诱导ICD重编程TIME是解除免疫耐受的重要策略,对于研究新型的脑肿瘤疗法具有潜在的应用价值。本研究通过乳化-高压均质法制备了一种基于白蛋白和乳铁蛋白的仿生嵌合纳米给药系统用于共递送双硫仑和紫草素,实现脑胶质瘤靶向和治疗。紫草素是来源于中药紫草的主要活性成分,它是糖酵解的关键酶——丙酮酸激酶同工酶2（Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2）的抑制剂,可有效抑制肿瘤细胞糖酵解及乳酸产生,还能够诱导肿瘤细胞ICD引起肿瘤局部免疫反应。双硫仑是一种不可逆的乙醛脱氢酶（Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH）抑制剂,本课题发现双硫仑可以有效地抑制ALDH1蛋白家族L1（ALDH1L1）,从而抑制肿瘤细胞能量供应的替代途径。同时,双硫仑具有FROUNT抑制作用,能够调控肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）。因此,联合应用双硫仑和紫草素可通过抑制葡萄糖-糖酵解/叶酸-NADH-ATP代谢轴,激活肿瘤免疫反应,重编程TIME来治疗脑胶质瘤。为了实现脑部药物递送,设计了基于白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米共递药系统（BSA/LF NP）。研究结果表明,仿生白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米共递药系统通过多受体介导（SPARC和LRP-1）高效地穿透血脑屏障并蓄积于肿瘤部位。基于共递送策略,双硫仑和紫草素能以协同比例蓄积于脑胶质瘤部位,BSA/LFNP表现出最佳的脑胶质瘤靶向效果,其肿瘤药物蓄积较游离药物组提高了 10倍以上,较BSANP组提高了 1.6倍。机制研究表明,联合治疗能有效地抑制葡萄糖-糖酵解/叶酸-NADH-ATP代谢轴,耗竭肿瘤细胞内ATP并减少乳酸产生,同时紫草素诱导ICD效应能有效激活T细胞免疫,抑制调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）,以及双硫仑介导的TAMs调控,从而发挥免疫治疗的作用。本研究设计了一种白蛋白和乳铁蛋白嵌合共递药系统,通过多受体介导实现高效脑胶质瘤药物递送,并通过肿瘤代谢（葡萄糖-糖酵解/叶酸-NADH-ATP代谢轴）和免疫（SHK诱导的ICD激活免疫应答和DSF介导的巨噬细胞调控）的调控作用来治疗脑胶质瘤,为脑部肿瘤治疗提供了一种潜在的递药及治疗策略。
王耀辉[3]（2020）在《TSP2在胶质瘤相关癫痫中的作用机制研究》文中指出目的:脑胶质瘤患者常继发癫痫发作,其中部分患者对常规抗癫痫药物不敏感,严重影响患者的生活质量。脑肿瘤患者继发癫痫发作是多因素的,现有的研究认为肿瘤本身生物学特性和瘤周微环境变化可能共同决定脑肿瘤患者的继发性癫痫发作,可能的病理生理变化包括肿瘤细胞基因改变、脑组织神经网络和神经调节功能异常、神经胶质细胞功能改变、瘤周血供和血管通透性改变、瘤周组织水肿、瘤周炎症因子和代谢活性分子的大量释放等。凝血酶敏感蛋白（thrombospondins,TSP）是一种寡聚多糖胞外基质蛋白,在血管生成、炎症反应、成骨反应、细胞增殖和凋亡等多种病理生理过程中介导细胞与细胞、细胞与细胞基质之间的相互作用。近期的研究发现在多种神经系统疾病模型中,TSP具有促进兴奋性突触表达的作用。同时,TSP的部分亚型受体是α2δ1,一种电压门控钙通道（voltagegated calcium channel,VGCC）的辅助亚单位,其von willebrandbrand factor（v WF-A）结构域可与TSP的表皮生长因子序列（epidermal growth factor,EGF）结构域结合,共同介导兴奋性突触发生。目前,癫痫发生机制学说主要包括神经递质及其受体失衡学说、兴奋性突触与抑制性突触失衡学说、离子通道学说等。结合TSP的已有研究结果,我们推测:胶质瘤来源的TSP与其受体α2δ1结合,可能促进瘤周兴奋性突触的发生和重塑,引起瘤周皮层“兴奋-抑制”失衡,进而导致胶质瘤继发性癫痫的发生。方法:1、体外培养C6胶质瘤细胞,利用立体定向微量注射的方法在大鼠皮层移植成瘤。利用神经功能评分（neurological score scale,NSS）、脑组织HE染色、免疫组化染色和在体皮层脑电记录综合评价模型是否构建成功和该模型用于肿瘤相关癫痫发生机制研究的可行性。2、通过Western Blot和免疫组化染色分析TSP2在胶质瘤模型大鼠中的表达水平;过表达或敲除C6胶质瘤细胞的TSP2基因,通过免疫荧光双标染色、高尔基染色、透射电镜和在体皮层脑电记录分析C6胶质瘤细胞中TSP2表达水平对瘤周突触可塑性变化和瘤周皮层兴奋性的影响。3、通过Western Blot和免疫荧光染色分析TSP2受体及其下游信号分子（α2δ1、Rac1）在模型大鼠瘤周皮层中的表达差异;并进一步利用在体皮层脑电记录,分析TSP2/α2δ1通路的拮抗剂Gabapentin对瘤周皮层兴奋性的影响。结果:一、C6胶质瘤细胞皮层移植模型大鼠（C6移植模型）的构建及评价NSS评分结果显示构建模型后第10天,模型组大鼠评分明显高于假手术组大鼠,此后模型组大鼠NSS评分趋于稳定。脑组织大体解剖标本和HE染色可见C6胶质瘤细胞成瘤于大鼠皮层,瘤周发生一系列病理改变。免疫组化染色显示瘤周Neu N、MAP2和GFAP表达发生变化。在体皮层脑电结果显示瘤周皮层痫样放电频率增加。二、TSP2在C6移植模型瘤周皮层中的作用Western Blot和免疫组化染色显示TSP2在C6移植模型瘤中心表达上调。免疫荧光染色结果显示突触素蛋白在胶质瘤瘤周表达上调。免疫荧光染色、高尔基染色和透射电镜结果分别显示野生型胶质瘤瘤周兴奋性突触数量、突触棘密度和突触密度增加,在体皮层脑电显示野生型胶质瘤瘤周痫样放电频率上调。过表达或敲除胶质瘤细胞TSP2基因后,瘤周兴奋性突触数量和突触棘密度分别上调和下调,瘤周痫样放电频率分别增加和降低。TSP2的表达水平对瘤周抑制性突触的表达无影响。三、TSP2介导瘤周突触发生可能的下游分子机制Western Blot结果显示TSP2的下游信号分子α2δ1在瘤周表达上调,免疫荧光染色结果与此结果一致。α2δ1的下游信号分子Rac1也在瘤周表达上调。通过TSP2/α2δ1信号通路的拮抗剂Gabapentin对模型大鼠予以干预,在体皮层脑电结果显示Gabapentin具有降低瘤周皮层痫样放电程度的作用。上述证据提示:TSP2可能通过α2δ1/Rac1通路介导瘤周皮层的突触发生。结论:1、TSP2在胶质瘤相关癫痫模型大鼠的瘤中心表达上调。2、胶质瘤来源的TSP2可能通过α2δ1/Rac1信号通路引起瘤周兴奋性突触数量上调和突触结构异常,进而导致瘤周皮层兴奋性增强。3、TSP2/α2δ1通路的拮抗剂Gabapentin可部分降低瘤周皮层兴奋性,可能是预防胶质瘤相关癫痫发生的新靶点。
吴剑花[4]（2020）在《蒿甲醚体外抗舌鳞癌的作用和机制研究》文中提出[目 的]舌鳞癌是一种最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,其恶性程度较高、侵袭性强、极易复发。舌鳞癌患者常采用放疗、手术及化疗等综合序贯治疗,但目前患者的五年生存率并未显着提高。天然药物蒿甲醚是一种青蒿素的衍生物,能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长,具有潜在的抗肿瘤作用,但其抗舌鳞癌作用和分子机制尚不明了。本研究以口腔舌鳞癌细胞为研究对象,在体外分析蒿甲醚对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响,明确蒿甲醚的抗肿瘤作用,重点关注蒿甲醚对HSP90/AKT的影响以及从miRNA角度来探索蒿甲醚体外抗舌鳞癌的分子机制,为蒿甲醚治疗舌鳞癌提供理论依据和实验基础。[方法]（1）CCK8法检测不同浓度蒿甲醚处理前后细胞增殖抑制率。（2）流式细胞仪检测不同浓度蒿甲醚处理前后细胞周期和凋亡率。（3）蛋白免疫印迹实验检测不同浓度蒿甲醚处理前后凋亡相关蛋白表达。（4）实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测蒿甲醚处理前后HSP90α和AKT mRNA和蛋白表达水平的变化。（5）免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）及 Duolink 原位邻位连接技术检测蒿甲醚处理前后HSP90α和AKT蛋白相互作用。（6）通过生物信息学数据库（microRNA.org,TargetScan 和 miRTarBase）对靶向AKT的miRNA进行预测分析并结合文献报道筛选miRNAs,采用实时荧光定量PCR检测蒿甲醚处理前后miRNAs变化,筛选出差异表达的miRNA为miR-29a-3p。（7）生物信息学分析和双荧光素酶报告检测通过生物信息学数据库查询预测miR-29a-3p可结合AKT2-3’ UTR和AKT3-3’UTR,双荧光素酶分析验证。（8）构建稳定敲低miR-29a-3p的舌鳞癌Cal-27细胞株即Cal-27-hsa-miR-29a-3p inhibitor sponge 和阴性对照细胞株即 Cal-27-shNC。0.10 mg/ml 的嵩甲醚处理上述细胞24 h后,以未处理组为对照,采用CCK8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测凋亡率;蛋白免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白表达。（9）所有实验数据均以“均数土标准差”表示,应用统计软件SPSS25.0对实验数据进行统计分析,采用单因素方差分析和student’s-t检验对各组独立样本进行分析,组间两两比较采用LSD-t检验,p<0.05有统计学意义,p<0.01统计学有显着差异。用GraphPad Prism5.0软件绘制统计图。[结 果]（1）蒿甲醚能抑制舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞增殖,使Cal-27细胞周期阻滞于G2/M期CCK8法检测各组细胞增殖活力发现蒿甲醚对舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞的增殖活力具有抑制作用,细胞增殖抑制率随蒿甲醚浓度增高而增强,具有浓度依赖性（p<0.01）。流式细胞仪对各组细胞行细胞周期检测结果表明蒿甲醚使Cal-27细胞周期阻滞于G2/M期（p<0.01）。（2）蒿甲醚能诱导舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞凋亡,上调Cal-27细胞cleaved caspase 3表达和下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达流式细胞仪检测发现不同浓度蒿甲醚处理Cal-27和SCC-15细胞组凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义（p<0.01）。免疫印迹法进一步检测凋亡相关蛋白结果发现,与对照组相比,蒿甲醚处理组舌鳞癌Cal-27细胞中Bax和Bad促凋亡蛋白表达量无明显变化（p>0.05）。但蒿甲醚可明显上调cleaved caspase 3的表达和下调Bcl-2的表达（p<0.01）。（3）蒿甲醚能下调舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α的mRNA和蛋白表达qRT-PCR检测发现蒿甲醚能下调舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α的mRNA即HSP90AAlmRNA表达,并呈浓度和时间依赖性。免疫印迹法检测发现HSP90α蛋白的表达趋势与HSP90AA1 mRNA相似。（4）蒿甲醚能下调舌鳞癌Cal-27细胞中AKT和p-AKT蛋白表达qRT-PCR检测发现蒿甲醚对舌鳞癌Cal-27细胞中AKT mRNA表达无明显影响（p>0.05）。而免疫印迹检测发现蒿甲醚能下调Cal-27细胞中AKT和p-AKT蛋白表达（p<0.05）。（5）蒿甲醚能抑制舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α与AKT之间蛋白互作免疫共沉淀检测发现在舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α和AKT存在蛋白互作,蒿甲醚处理后两者互作减弱。进一步采用Duolink原位蛋白邻位连接技术验证也获得相似结果。（6）蒿甲醚能上调舌鳞癌Cal-27细胞中miR-29a-3p表达,进而负性调控AKT3采用生物信息学数据库筛选出可能靶向调控AKT的5个miRNAs,qRT-PCR验证,检测发现蒿甲醚可上调舌鳞癌Cal-27细胞中miR-29a-3p表达。生物信息学分析显示miR-29a-3p可结合AKT2-3’UTR和AKT3-3’UTR。双荧光素酶分析检测发现在293T细胞中,miR-29a-3p与AKT2-3’UTR没有结合;但与AKT3-3’UTR的两个靶点均能结合,进而负性调控AKT3表达水平。（7）miR-29a-3p功能缺失能下调蒿甲醚体外抗舌鳞癌Cal-27细胞作用CCK8法检测发现敲低miR-29a-3p能下调蒿甲醚对舌鳞癌Cal-27细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测发现敲低miR-29a-3p能减弱蒿甲醚对Cal-27细胞凋亡的诱导作用;免疫印迹检测发现敲低miR-29a-3p能减弱蒿甲醚对cleaved caspase 3表达的促进作用、降低蒿甲醚对抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制作用、削弱蒿甲醚对AKT3和p-AKT3表达的下调作用。[结论]（1）蒿甲醚能抑制舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞增殖,将Cal-27细胞周期阻滞于G2/M期;蒿甲醚能下调Cal-27细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达和促进Caspase 3活化,诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。（2）蒿甲醚可能通过下调HSP90α、AKT和p-AKT表达,并抑制HSP90α和AKT二者之间蛋白互作;同时,其可能通过上调miR-29a-3p,负性调控AKT3表达,抑制AKT信号通路,发挥抗舌鳞癌作用。
曾纹鑫[5]（2019）在《不同级别人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠异种皮下移植瘤模型的建立及其生物学特征》文中提出研究背景:人脑胶质瘤是成年人中发病率最高、预后不良的原发性脑肿瘤,由世界卫生组织（World Health Organization,WHO）分级的Ⅰ-Ⅳ级不同恶性程度的脑肿瘤组成。弥漫性胶质瘤因其丰富的新生血管和浸润性生长的特性,导致肿瘤复发,严重威胁着人类的生命健康。尤其是恶性程度最高的胶质母细胞瘤,预后极差,患者的平均中位生存期仅为14.8月,5年生存率不到3%。胶质瘤起源于中枢神经系统的胶质细胞,异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase,IDH）突变是驱动胶质瘤发生的早期关键事件。据此,2016年WHO将IDH突变状态、1p/19q共缺失和其它基因（如ATRX缺失、TP53突变）状态引入胶质瘤的诊断归类中,形成了联合组织学和分子学共同特征的“整合诊断”新标准,即将前期以组织学特征命名的星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤对应地分为弥漫性星形细胞瘤（IDH突变型、IDH野生型和NOS型）、少突胶质细胞瘤（IDH突变和1p/19q共缺失和NOS型）少突星形细胞瘤,NOS型和胶质母细胞瘤（IDH突变型、IDH野生型和NOS型）。其中弥漫性星形细胞瘤由WHO Ⅱ级弥漫性星形细胞瘤,IDH突变型和WHO Ⅲ级间变性星形细胞瘤,IDH突变型组成;少突胶质瘤可由WHO Ⅱ级的少突胶质细胞瘤,IDH突变和1p/19q共缺失以及WHO Ⅲ级的间变性少突胶质细胞瘤,IDH突变和1p/19q共缺失组成;而胶质母细胞瘤皆为恶性程度最高的WHO Ⅳ级组成,分为胶质母细胞瘤,IDH突变型,胶质母细胞瘤IDH野生型以及儿童的弥漫性中线胶质瘤,H3K27M突变型。不同胶质瘤类型在基因突变、恶性分级、临床表现、生长方式以及对治疗的敏感性、反应性和临床结局等方面存在高度异质性和复杂性,由此导致胶质瘤的治疗效果仍不理想的结局。而研究和开发出有效的肿瘤特异性治疗方法或药物是目前解决这一困境的热点和焦点课题。建立可靠的能够模拟患者生物学特性的临床前动物模型是实现胶质瘤个体化治疗和药物筛选与评价的关键途径。基于传统的来源于胶质瘤细胞系如U87、U251、T98G的移植瘤,由于这些细胞经过长期的体外培养,其生物学特性与人胶质瘤有巨大差异,不能代表人胶质瘤的生物学特征。胶质瘤患者源性异种移植瘤（Patient-derived Xenografts,PDXs）在肿瘤形态和分子生物学等特征方面与人脑胶质瘤特性最为接近,被公认为目前最可靠的胶质瘤临床前研究模型。有关胶质瘤的PDXs研究主要集中于脑原位的PDXs和皮下PDXs两大类。将患者胶质瘤组织消化经过短期培养获得肿瘤细胞或干样肿瘤细胞移植至动物脑原位建立的患者源性原位异种移植（Patient-derived Orthotopic Xenograft,PDOX）模型与患者原发肿瘤在组织形态、生长方式以及分子遗传等方面有很大程度的相似性,且简便可行。但由于移植细胞为肿瘤实质细胞,缺少肿瘤细胞赖以生存和演进的基质细胞如成纤维细胞、免疫细胞或血管内皮细胞等,故而缺乏影响肿瘤生长的微环境。新鲜组织块的PDOX模型实施难度较大,早期有两个研究团队先后报道通过组织块法成功建立了胶质母细胞瘤PDOXs,但最近韩国学者报道应用组织块法未能成功建立PDOX模型。除PDOX模型外,将胶质瘤患者来源的组织块移植于免疫缺陷小鼠皮下建立的胶质瘤异位PDXs因具有操作简单、方便,移植瘤易于观察和传代等优点而广泛应用于生物样本库的建立、新药筛选与测试、患者预后的生物标记预测以及患者个性化治疗研究。目前通过组织块法建立的胶质瘤异位PDX模型主要集中于人胶质母细胞瘤,这些研究报道移植瘤仅在皮下呈局限性生长,从未观察到皮下移植瘤的侵袭和复发。同时包括WHO Ⅱ—Ⅳ级在内的多种级别联合胶质瘤PDXs模型的建立及其生物学特性的研究并未见报道。基于以上研究背景,我们的研究围绕以下两个部分展开:1.在获得患者知情同意后,收集WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤患者术中手术切除的肿瘤组织,经皮下移植到NOD-Prkdcscid 112rgnull（NPG）小鼠建立PDX模型,通过大体观察移植瘤存活情况,统计分析成瘤与患者临床参数的相关性,确定成瘤与胶质瘤患者年龄、性别以及胶质瘤级别、IDH突变状态和核增殖指数Ki67表达的相关性;待移植瘤生长至合适大小,进行传代至1-6代,应用游标卡尺测量移植瘤生长,评价各代次移植瘤生长潜伏期和生长速度;手术切除肉眼所见的全部移植瘤,观察切除后的移植位置是否再次生长出移植瘤,评价移植瘤保持患者胶质瘤的复发特性;通过观察除移植位置之外的移植瘤生长情况,评价移植瘤保持患者胶质瘤的侵袭性生长或扩散生长的特性。通过上述研究,以期评价患者胶质瘤来源的异种移植瘤模型成功建立的相关因素及其生长特性。2.取不同代次的移植瘤和患者胶质瘤,通过苏木素伊红（H&E）染色、免疫组织化学染色评价不同代次移植瘤是否保持了患者胶质瘤的组织学和免疫学特征;通过荧光定量q-PCR评价不同代次移植瘤是否保持了患者胶质瘤的携带IDH基因状态;最后应用短串联重复序列（Short Tandem Repeat,STR）技术鉴定了移植瘤与患者胶质瘤在微卫星稳定性方面的一致性。通过上述研究,我们成功建立起WHO Ⅱ—Ⅳ级人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠皮下PDX模型,移植瘤成功率有赖于胶质瘤的IDH野生状态和核增殖指数Ki67的高表达状态,移植瘤保持患者胶质瘤弥漫侵袭性生长特性,形态组织学特征以及分子遗传学特征,为胶质瘤发病机制、新药发现与筛选以及患者个体化治疗等研究提供理想的疾病模型。第一部分:不同级别人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠异种皮下移植瘤模型的建立及其生长特性方法在取得患者知情同意书后,收集在重庆医科大学附属第一医院脑外科就诊的WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤患者手术标本和临床数据,将胶质瘤剪成3-5mm大小后,经皮下移植到NPG小鼠背部两侧,通过观察移植瘤存活、生长速度、生长方式,分析移植瘤存活与胶质瘤患者性别、年龄和胶质瘤级别、大小、IDH突变状态以及核增殖抗原Ki67的相关性。待移植瘤长至直径约为1.5cm或两处肿瘤生长接触时,取部分移植瘤再次经皮下移植到新的NPG小鼠进行肿瘤传代。成瘤后,每周测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,评价不同代次移植瘤生长潜伏期、生长特点。手术切除肉眼所见的全部移植瘤,观察切除后的移植位置是否再次生长出移植瘤,评价移植瘤保持患者胶质瘤的复发特性;通过观察除移植位置之外的移植瘤生长情况,评价移植瘤保持患者胶质瘤的侵袭性生长或扩散生长的特性。通过上述研究,以期确定出建立人源性胶质瘤异种移植瘤的成瘤率与患者临床参数的相关性、移植瘤保持患者胶质瘤的生长特性。结果在收集的28例手术胶质瘤标本中,16例进行了有效移植,因标本污染或移植后1个月小鼠内死亡而排除12例。在有效移植的16例中,WHO Ⅱ级胶质瘤3例,Ⅲ级5例以及Ⅳ级8例。对胶质瘤患者临床参数与移植瘤成功的相关性进行统计分析,发现胶质瘤移植成功与高于5%的Ki67表达（11/13 vs.0/3,P=0.004）和IDH1野生型呈正相关(（9/9 vs.2/7,P=0.002）,而与患者年龄、性别、胶质瘤大小无关。总体移植成功率为68.75%（11/16）,其中Ⅱ级移植成功率为33.3%（1/3）,Ⅲ级移植成功率为60%（3/5）,Ⅳ级移植成功率为87.5%（7/8）。随着胶质瘤的级别增加,移植成功率呈增加的趋势,但并无统计学差异。对移植瘤生长曲线分析,发现患者胶质瘤移植小鼠后经过一个潜伏期,其中P1代Ⅱ级潜伏期为11周,Ⅲ级潜伏期在14～22周之间,Ⅳ级则为5～22周,后进入快速生长期,低级别胶质瘤的潜伏期相较于高级别胶质瘤更长;第2代及其以后代次则潜伏期较短或无潜伏期。有趣的是,Ⅲ级间变性少突胶质瘤IDHMUT在移植处位置之外扩散性新生了移植瘤。同时,我们还观察到Ⅱ级弥漫性星形细胞胶质瘤IDHWT移植瘤第二代（P2）和Ⅳ级胶质母细胞瘤IDHWT复发肿瘤在移植瘤第三代（P3）切除移植瘤后肿瘤复发。结论通过人胶质瘤患者的新鲜组织块移植法建立起人源性WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤NPG小鼠皮下PDX模型,胶质瘤成功移植与表达率高于5%的Ki67和IDH1野生状态相关,成功率在33.3-87.5%之间;移植瘤在P1代经过5～22周的潜伏期后进入快速生长期,第2代及其以后代次潜伏期较短或无潜伏期;另外,移植瘤还保持了患者胶质瘤向远处扩散的侵袭性和手术切除后复发性生长的特性。第二部分:人源性胶质瘤PDX模型的鉴定及其生物学特征方法待移植瘤生长至直径约为1.5cm大小时,取部分移植瘤进行下述三方面研究:1.移植瘤传代:当移植瘤生长至合适大小时,无菌手术操作取移植瘤经皮下移植到新的NPG小鼠背部一侧或两侧,进行肿瘤传代,最多传至6代;2.另取部分移植瘤进行液氮冷冻保存,以备移植瘤复苏或其它用途;3.比较各代次移植瘤在组织形态学、免疫表型、新生血管、增殖能力以及遗传学等方面与对应患者的胶质瘤特性代表性,具体进行下述3方面内容研究:（1）取各代次移植瘤和患者胶质瘤组织块,经10%中性缓冲福尔马林固定后,行脱水、透明、包埋、切片以及H&E染色,光学显微镜观察各代次移植瘤和患者胶质瘤的组织形态、结构以及组成成分的特征和变化,评价移植瘤与对应患者胶质瘤在组织形态以及病理改变是否具有相似的特征;（2）取上述移植瘤和患者胶质瘤石蜡切片或冰冻切片,应用免疫组织化学研究胶质瘤特异性表达分子胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）、少突胶质细胞特异转录因子（Oligodendrocyte Lineage Transcription Factor2,Olig-2）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平,评价移植瘤在瘤细胞分化程度方面与患者胶质瘤的异同;应用抗人和抗小鼠血管内皮表达分子CD31单克隆抗体进行免疫荧光双标染色,评价各代次移植瘤在多大程度上保持了患者肿瘤的血管;应用核增殖标记分子Ki67免疫组织化学染色法,对照研究移植瘤和患者胶质瘤增殖能力的异同。通过这些研究,以期评价各代次移植瘤与患者胶质瘤在免疫表型、血管新生以及增殖能力方面的一致性;（3）提取各代次移植瘤和对应患者胶质瘤DNA,应用实时荧光定量Q-PCR法研究各代次移植瘤在胶质瘤分子分型基因IDH携带状态方面是否保持了对应患者胶质瘤的一致性;利用STR技术研究各代次移植瘤和患者胶质瘤在遗传微卫星多态的稳定性;通过上述研究,以期评价移植瘤维持对应患者胶质瘤遗传学特征的稳定性。结果H&E染色结果显示,WHO Ⅱ—Ⅳ级患者源性的移植瘤保持了各自级别胶质瘤在组织病理形态学方面的异质性和多样性;同一级别的各代次移植瘤总体保持了对应患者胶质瘤的组织结构和形态特征,但在细胞密度、异型性以及血管内皮细胞增殖方面,移植瘤较患者胶质瘤增强。GFAP、Vimentin和Olig-2免疫染色结果显示,移植瘤维持了患者胶质瘤的关键免疫表型,但其GFAP表达下降和波形蛋白表达增加。免疫荧光双标人和小鼠CD31表达结果显示,与对应患者胶瘤相比,PDX肿瘤组织鼠源性血管内皮细胞CD31表达增加,而人源性血管内皮细胞CD31表达减少。Ki67结果表明,PDX肿瘤细胞的增殖能力明显强于患者胶质瘤。IDH基因表明,大部分PDX肿瘤保持了患者胶质瘤IDH基因携带情况,仅一例IDH1野生型的胶质母细胞瘤在P1代发生了 R132H突变,但在随后的传代中又发生回复突变成IDH1野生型。STR结果显示,不同患者来源的不同级别的胶质瘤个体间保持了个体独特的异质性,而大多数各代次的移植瘤严格保存了患者来源的胶质瘤微卫星DNA特征,仅两例标本出现了基因片段的丢失。结论利用NPG小鼠建立起的源于人WHO Ⅱ—Ⅳ级脑胶质瘤移植瘤在生长方式、组织形态学、免疫表型和基因学特征上都与对应患者肿瘤保持高度一致性,可为胶质瘤发病机制、临床前新药筛选与评价以及患者个性化治疗提供有效策略。
刘道洲[6]（2019）在《脑靶向siPD-L1和替莫唑胺共递送系统的构建及其抗耐药脑胶质瘤活性研究》文中研究说明脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。目前临床治疗脑胶质瘤的标准方案是:手术切除联合放射治疗和3个疗程的替莫唑胺（TMZ）化疗,但脑胶质瘤对TMZ容易产生耐药,导致患者的中位生存时间仅为14.6个月。最新研究发现,脑胶质瘤对TMZ的耐药不仅与脑胶质瘤自身基因表达相关,肿瘤微环境也促进了耐药的产生。我们研究发现程序性死亡受体-1（PD-1）的配体（PD-L1）在耐TMZ（以下简称耐药）脑胶质瘤细胞中高表达。据报道,PD-L1高表达会导致PD-1/PD-L1信号通路持续激活,使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和杀伤,并促进肿瘤的生长,加剧肿瘤耐药。当我们采用特定序列的siPD-L1抑制耐药脑胶质瘤细胞PD-L1的表达后,耐药脑胶质瘤细胞中耐药蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）的表达也明显降低,TMZ对耐药脑胶质瘤的抑制作用明显增强。上述结果提示,通过使用PD-L1特异的siRNA（siPD-L1）沉默耐药脑胶质瘤中PD-L1的表达,不仅能抑制肿瘤微环境中PD-1/PD-L1通路的激活,提高机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,而且还能通过降低MGMT的表达,提高耐药脑胶质瘤对TMZ的敏感性,增强TMZ对耐药脑胶质瘤细胞的毒性,以双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长,提高对耐药脑胶质瘤的治疗效果。然而,siPD-L1在血液循环中不稳定,容易被体内的RNA酶降解,被肾脏迅速清除,加之体内诸多生物屏障（如血脑屏障）对siPD-L1转运的阻碍作用,极大地限制了siPD-L1在脑胶质瘤中的蓄积。如何使siPD-L1在血液循环中稳定,顺利穿过血脑屏障,并高效进入耐药脑胶质瘤细胞浆发挥基因沉默效应,是治疗耐药脑胶质瘤的关键。目的:制备共载siPD-L1和TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒,提高siPD-L1在血液中的稳定性;纳米粒通过葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并高效进入耐药脑胶质瘤细胞,释放siPD-L1和TMZ,沉默耐药脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达,增强机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐药脑胶质瘤对TMZ的敏感性,以双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长。方法:（1）以聚天冬氨酸（PASP）和不同分子量聚乙烯亚胺（PEI,分子量分别为600、1200和1800）为原料,通过二硫键将不同分子量PEI枝接在PASP侧链,合成新型阳离子聚合物PASP-g-PEI600、PASP-g-PEI1200和PASP-g-PEI1800,用于压缩siPD-L1;以2-脱氧葡萄糖（Glu）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）为原料,合成2-脱氧葡萄糖修饰的连接物（DSPE-PEG-Glu）,作为脑靶向和脑胶质瘤靶向材料。采用核磁氢谱（1H NMR）对产物的结构进行鉴定。（2）以DSPE-PEG-Glu、胆固醇及二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）构成的脂质薄膜为壳,以siPD-L1与PASP-g-PEI形成的复合物为核,采用薄膜分散法制备共载siPD-L1及TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒TMZ/siPD-L1@GLPN（PASP-g-PEI）,并以氮磷比（N/P）、粒径、zeta电位、TMZ载药量、环境响应特性及siPD-L1稳定性等为指标对纳米粒进行表征,筛选出压缩siPD-L1效果最佳的PASP-g-PEI连接物。（3）采用细胞毒性实验、溶血实验及小鼠体内实验对空白对照纳米粒scrambled siRNA@PEI25K、scrambled siRNA@PASP-g-PEI1200、scrambled siRNA@PASP-g-PEI1800和scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)的毒性进行体内外评价（scrambled siRNA为无功能的错配siPD-L1,下同）。（4）设计8条不同序列的siPD-L1,通过western blot法筛选出对脑胶质瘤C6细胞中PD-L1沉默效果最好的siPD-L1序列。（5）通过western blot法检测TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)对脑胶质瘤C6细胞及耐TMZ脑胶质瘤C6细胞（C6/TR细胞）中目标基因PD-L1的沉默效果;通过细胞毒性实验、克隆形成实验、迁移实验及侵袭实验等考察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)对C6细胞及C6/TR细胞增殖、迁移和侵袭的影响;通过western blot法考察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)对C6/TR细胞中MGMT表达的影响。（6）采用激光共聚焦显微镜考察C6细胞及C6/TR细胞对siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)的摄取,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)入胞后在C6/TR细胞内的分布,以及siPD-L1在C6/TR细胞浆内与PASP-g-PEI1800的解离情况。（7）建立体外血脑屏障模型,通过荧光分光光度计、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)穿透血脑屏障的效率,血脑屏障模型中bEnd3细胞及C6/TR细胞对scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)的摄取。建立体外血脑屏障与3D脑胶质瘤细胞球结合模型,考察scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)穿过血脑屏障后对C6/TR细胞球的穿透力。（8）将荧光素酶标记的C6细胞、C6/TR细胞注射入ICR小鼠脑组织,构建原位脑胶质瘤模型,模型建立后第7天,尾静脉注射TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800),每3天给药一次,连续给药4次,通过活体成像仪观察脑胶质瘤的大小;最后一次给药2天后,采用western blot法考察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)对脑胶质瘤组织内PD-L1及MGMT表达的影响;在模型建立第28天,采用流式细胞仪检测TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)对C6细胞和C6/TR细胞原位脑胶质瘤脑组织中效应T细胞、调节性T细胞数量的影响;记录荷瘤小鼠的生存时间。（9）采用活体成像仪观察TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)在荷原位脑胶质瘤小鼠和正常小鼠脑部的分布;采用荧光显微镜观察脑组织切片中脑胶质瘤区域与正常脑组织区域中TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)的分布;采用高效液相色谱（HPLC）检测TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)转运TMZ在小鼠血浆及主要器官组织内的分布。结果:（1）合成了DSPE-PEG-Glu及PASP-g-PEI,结构鉴定表明合成的产物为目标化合物;PASP-g-PEI1800（PEI分子量为1800）能较好地压缩siPD-L1,压缩效果与PEI25K相当,而且siPD-L1@PASP-g-PEI1800在谷胱甘肽（GSH）存在的条件下能释放出siPD-L1;制备了核壳形脂质聚合物纳米粒TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800),TMZ的载药量为5.23%,粒径为92 nm,zeta电位为-33 mV,形态为球形;siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能够提高siPD-L1在血清中的稳定性。（2）体内外安全性评价结果显示,相较于scrambled siRNA@PEI25K,scrambled siRNA@PASP-g-PEI1800的细胞毒性、对红细胞的破坏作用及对小鼠的肝肾毒性明显降低。scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)进一步降低了scrambled siRNA@PASP-g-PEI1800的体内外毒性。（3）cd274-mus-362是对C6细胞中PD-L1蛋白沉默效果最佳的siPD-L1序列。（4）Western blot结果显示,相比于C6细胞,C6/TR细胞PD-L1和MGMT蛋白表达显着提高;TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能够显着降低C6细胞及C6/TR细胞中PD-L1的表达,明显降低C6/TR细胞内MGMT的表达。体外抗肿瘤实验结果显示,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能够显着抑制C6细胞和C6/TR细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,其抑制作用明显强于没有2-脱氧葡萄糖修饰的对照纳米粒TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI1800)以及游离TMZ。（5）激光共聚焦显微镜观察结果显示,与没有2-脱氧葡萄糖修饰的纳米粒siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI1800)相比,siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)在C6细胞及C6/TR细胞内的蓄积明显增多,根皮苷能够抑制C6细胞及C6/TR细胞对siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)的摄取,提示siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)通过葡萄糖转运体介导进入脑胶质瘤细胞内。TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)进入C6/TR细胞后能大量分布于细胞浆中,仅有少量纳米粒分布在溶酶体内;在C6/TR细胞浆中,siPD-L1能与PASP-g-PEI1800解离。（6）体外血脑屏障模型研究结果显示scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)穿过血脑屏障的效率显着高于没有2-脱氧葡萄糖修饰的空白对照纳米粒scrambled siRNA@LPN(PASP-g-PEI1800);scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)在bEnd3细胞及C6/TR细胞内的蓄积均显着高于scrambled siRNA@LPN(PASP-g-PEI1800);scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)穿过血脑屏障后能够有效渗透到体外3D耐药脑胶质瘤细胞球的深部区域。提示2-脱氧葡萄糖修饰提高了scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)穿过血脑屏障的效率,scrambled siRNA@GLPN(PASP-g-PEI1800)对脑胶质瘤组织具有较强的穿透力。（7）成功建立了ICR小鼠原位脑胶质瘤模型。研究结果显示,在C6细胞原位脑胶质瘤模型中,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能显着抑制脑胶质瘤的生长,荷瘤小鼠生存时间明显延长,在接种脑胶质瘤细胞后100天,仍有53.3%的小鼠存活,治疗效果明显优于游离TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI1800)及siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)。在C6/TR细胞原位脑胶质瘤模型中,游离TMZ不能抑制耐药脑胶质瘤的生长,但是TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)却能显着抑制耐药脑胶质瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间;Western blot结果显示,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能显着降低耐药脑胶质瘤组织内PD-L1及MGMT的表达。流式细胞仪测定结果显示,在C6细胞和C6/TR细胞原位脑胶质瘤模型中,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)均能够增加脑组织中效应T细胞的数量,降低调节T细胞的数量。（8）活体成像仪观察结果显示,与TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI1800)相比,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)在荷瘤小鼠和正常小鼠脑部的蓄积明显增多;荧光显微镜观察结果显示,TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)在脑胶质瘤组织内的分布量明显高于正常脑组织;HPLC检测结果显示,相较于TMZ/siPD-L1@LPN(PASP-g-PEI1800),TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能够将更多的TMZ转运至小鼠脑组织。结论:TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能够有效压缩siPD-L1,提高siPD-L1在血清中的稳定性;TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)可被C6细胞及C6/TR细胞摄取,释放游离siPD-L1。siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)能够穿过血脑屏障,在脑胶质瘤组织内有效蓄积。TMZ/siPD-L1@GLPN(PASP-g-PEI1800)沉默耐药脑胶质瘤中PD-L1的表达不仅能抑制肿瘤微环境中PD-1/PD-L1通路的激活,提高机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,而且还能通过降低MGMT的表达提高耐药脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,增强TMZ对耐药脑胶质瘤细胞的毒性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长,提高对耐药脑胶质瘤的治疗效果。
李翔[7]（2019）在《RACK1在脑缺血再灌注损伤中的作用及作用机制的研究》文中指出目的:研究活化的蛋白激酶C1受体（RACK1）在脑缺血再灌注（I/R）损伤中的作用及其潜在的分子机制。方法:在体内建造成年雄性SD大鼠（250-280g）的大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型,在体外通过使培养的原代神经元暴露于氧气葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）的方法,分别模拟体内外I/R损伤,并且通过大鼠侧脑室内注射过表达质粒,在体内产生T50点突变（T50A）的RACK1过表达和野生型RACK1过表达,在体外通过神经元培养基内过表达质粒的转染,分别引起神经元内T50点突变RACK1过表达和野生型RACK1过表达。结果:在体内实验中大鼠MCAO 1.5h后半暗带神经元中RACK1蛋白水平降低,但其在苏氨酸/丝氨酸残基处的磷酸化水平显着升高,外源性质粒转染后,野生型RACK1过表达可减轻脑梗塞面积,脑水肿,神经元死亡,神经元组织缺失和神经行为功能障碍,而RACK1（T50A）过表达会加重I/R损伤。在体外实验中神经元在OGD/R后RACK1蛋白T50处的磷酸化会导致其从胞质核糖体转移到轴突,功能上从Beclin-1翻译抑制转换为自噬诱导。结论:在脑缺血再灌注损伤中RACK1蛋白T50处发生磷酸化,使其功能从Beclin-1翻译抑制转换成自噬诱导,提高早期缺血神经元的自噬水平,从而发挥神经保护作用。
曹棉富[8]（2019）在《TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制和多基因风险评分的预后价值》文中研究指明胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,预后极差。研究表明,肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）是胶质母细胞瘤微环境中浸润数目最多的免疫细胞,可通过高分泌细胞因子如TGF-β1、PTN等促进胶质母细胞瘤恶性进展。除此之外,TAM还可能与肿瘤细胞发生杂交从而影响肿瘤的多种生物学行为。然而,TAM与胶质母细胞瘤细胞杂交（TAM-GBM细胞杂交）是否存在,以及其在胶质母细胞瘤中的生物学作用及机制尚不清楚。另一方面,胶质母细胞瘤起源于神经胶质细胞或神经胶质前体细胞,其发生发展受多基因的调控。筛选调控胶质母细胞瘤发生发展的关键基因,并建立一个可用于胶质母细胞瘤预后预测的多基因风险评分模型具有十分重要的临床意义。因此,本研究包括以下两部分内容:第一部分肿瘤相关巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制本部分从细胞杂交的角度出发,研究TAM-GBM细胞杂交是否存在,TAM-GBM杂交细胞的转录组特征,以及TAM-GBM细胞杂交对胶质母细胞瘤侵袭的影响及机制。其主要的研究方法、结果及结论如下:1.胶质母细胞瘤中存在TAM-GBM细胞杂交（1）采用流式分析和免疫荧光对胶质母细胞瘤临床样本进行检测,结果显示胶质母细胞瘤临床样本中存在TAM-GBM杂交细胞,比例为1.35%1.96%;杂交细胞同时表达胶质母细胞瘤标记物(GFAP、PDGFRα和IDH1R132H)与巨噬细胞标记物（CD68和CD14）,并且杂交细胞的细胞核数量具有异质性,含13个细胞核不等。（2）采用流式检测、免疫荧光和荧光原位杂交对胶质母细胞瘤原位移植瘤进行分析,结果显示胶质母细胞瘤原位移植瘤中存在TAM-GBM杂交细胞,比例为1.91±0.01%;杂交细胞同时表达胶质母细胞瘤荧光标记RFP与小鼠巨噬细胞标记物CD11b,并且其在性别错配原位移植瘤（雌性来源的胶质母细胞瘤细胞原位注射于雄性C57BL/6小鼠）中的性染色体核型以“XXY”或“XXXY”多倍体为主。（3）采用流式检测、免疫荧光和EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）标记细胞核对TAM-GBM共培养体系进行分析,结果显示共培养体系中存在TAM-GBM杂交细胞,杂交效率与两种细胞共培养比例有关,以胶质母细胞瘤细胞比巨噬细胞的比例为1:4达最佳（相应杂交效率为1.20±0.02%）;杂交细胞共表达胶质母细胞瘤荧光标记RFP和巨噬细胞荧光标记GFP;在EdU标记的巨噬细胞-EdU未标记的胶质母细胞瘤细胞共培养体系中,以及在EdU未标记的巨噬细胞-EdU标记的胶质母细胞瘤细胞共培养体系中,均可检测到同时含1个EdU阳性细胞核和1个EdU阴性细胞核的杂交细胞。2.TAM-GBM杂交细胞的转录组特征采用转录组测序、生物信息学技术、实时荧光定量PCR等研究手段对TAM-GBM杂交细胞的转录组特征进行了分析,结果显示TAM-GBM杂交细胞形成了不同于两种亲本细胞的独特的转录组特征,其含有39个相对于两种亲本细胞均显着上调的基因和39个相对于两种亲本细胞均显着下调的基因;GO（Gene Ontology）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析显示TAM-GBM杂交细胞在趋化因子介导的信号通路、JAK-STAT信号通路等多条通路上呈显着富集。3.TAM-GBM细胞杂交促进胶质母细胞瘤侵袭我们采用了体外Transwell侵袭实验对TAM-GBM杂交细胞和亲本胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力进行了比较,结果显示TAM-GBM杂交细胞具有比亲本胶质母细胞瘤细胞更强的体外侵袭能力;通过对胶质母细胞瘤组织切片进行免疫荧光染色,并对比TAM-GBM杂交细胞在胶质母细胞瘤组织侵袭前沿与肿瘤核心区域的分布情况,我们发现相比于肿瘤核心区域,肿瘤侵袭前沿区域具有更多的TAM-GBM杂交细胞,提示TAM-GBM细胞杂交可促进胶质母细胞瘤侵袭。4.TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭机制的初步探讨我们对TAM-GBM杂交细胞和亲本胶质母细胞瘤细胞进行了胶质瘤侵袭相关基因的富集分析,结果显示胶质瘤侵袭相关基因在TAM-GBM杂交细胞中呈显着富集（NES=1.65,p<0.001）（NES,normalized enrichment score）。进一步采用了实时荧光定量PCR和流式检测对基因富集分析的结果进行验证,结果显示相比于亲本胶质母细胞瘤细胞,Hgf、Tmsb4x、St3gal1、Mmp13、Adam8和Cxcr4等侵袭相关基因在TAM-GBM杂交细胞中显着高表达,提示胶质瘤侵袭相关基因可能介导了TAM-GBM细胞杂交的促侵袭作用。第二部分多基因风险评分在胶质母细胞瘤中预后价值本部分从胶质母细胞瘤受多基因调控的角度出发,筛选调控胶质母细胞瘤发生发展的关键基因,并建立可用于胶质母细胞瘤预后预测的多基因风险评分模型。其主要的研究方法、结果及结论如下:1.胶质母细胞瘤差异基因的筛选及多基因风险评分模型的建立（1）我们首先分别对TCGA和GEO数据库中的胶质母细胞瘤数据集进行了差异分析,然后再对来自不同数据集的差异分析结果取交集,结果显示相比于正常脑组织,胶质母细胞瘤含有483个差异显着的上调基因和765个差异显着的下调基因。（2）上述差异基因行单因素和多因素COX回归分析,结果显示,OSMR、HOXC10、SCARA3和SLC39A10的表达水平与胶质母细胞瘤患者预后最为相关,其中差异上调基因OSMR、HOXC10和SCARA3与患者预后呈负相关（hazard ratio>1,p<0.05）,差异下调基因SLC39A10与患者预后呈正相关（hazard ratio<1,p<0.05）。（3）Western blot验证了OSMR、HOXC10和SCARA3在胶质母细胞瘤中高表达,而SLC39A10在胶质母细胞瘤中低表达。（4）基于OSMR、HOXC10、SCARA3和SLC39A10的基因表达水平和多因素COX回归系数,我们建立了胶质母细胞瘤的多基因风险评分模型。2.多基因风险评分在胶质母细胞瘤中的预后价值评估（1）我们采用了Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分别在TCGA和GEO胶质母细胞瘤数据集中对多基因风险评分的预后价值进行了评估,结果均显示多基因风险评分对患者生存时间有显着影响,风险评分越高,患者预后越差;进一步行单因素和多因素COX回归分析,结果显示多基因风险评分可作为胶质母细胞瘤患者的独立预后指标。（2）多基因风险评分联合胶质母细胞瘤IDH突变状态或表达谱亚型能更加具体、准确地预测不同亚组胶质母细胞瘤患者的预后:风险评分高且为IDH野生型的胶质母细胞瘤患者预后差,风险评分高且为间质型胶质母细胞瘤的患者预后也差。
解婷[9]（2019）在《IDH1突变对胶质瘤干细胞辐射敏感性的影响及其机制研究》文中研究表明目的:胶质瘤干细胞（Glioma stem cells,GSCs）是导致临床胶质瘤难以根治、容易复发的主要原因;近年来研究发现50%-80%的WHO Ⅱ级,Ⅲ级以及继发性恶性胶质瘤中伴有异柠檬酸脱氢酶1（Isocitrate dehydrogenasel,IDH1）基因发生突变;本课题的研究目的是以IDH1突变型GSCs为研究对象探讨IDH1基因突变对GSCs辐射敏感性的影响,并初步探讨其作用机制。方法:（1）在干细胞条件培养基下逆分化胶质瘤细胞,细胞培养至第十二代,通过全自动流式细胞分选仪,特异性识别胶质瘤干细胞表面干性标志物蛋白CD133,富集培养后得到GSCs。（2）构建IDH1-R132H突变基因过表达质粒,用Lipofectamine3000脂质体转染法将空载质粒与突变质粒转入胶质瘤干细胞中,得到空载胶质瘤干细胞与IDH1-R132H基因突变胶质瘤干细胞。（3）X射线照射后,采用细胞克隆形成实验和CCK8技术检测IDH1-R132H基因突变型GSCs的细胞增殖活力。（4）利用细胞免疫荧光实验检测对照组和实验组细胞在X射线照射4 Gy后不同时间γH2AX的数量。（5）在胶质瘤干细胞IDH1突变后,X射线照射4 Gy,用自动化流式细胞仪检测IDH1-R132H基因突变GSCs的细胞周期分布。（6）采用Western blot技术检测两组细胞在X射线照8 Gy,2 h后调节磷酸戊糖途径关键蛋白TIGAR的表达水平;（7）进一步采用NADP+/NADPH及谷胱甘肽检测试剂盒分别检测对照组和实验组细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值。结果:（1）细胞克隆形成实验表明,实验组细胞在X射线照射2、4、6、8 Gy后细胞克隆形成率分别为68.14%、42.07%、19.44%、13.35%,与对照组细胞相比,两组数据差异无统计学意义。（2）CCK8检测结果显示,在X射线照射前,实验组细胞平均OD值是对照组细胞的1.01倍,X射线照射4 Gy,8 Gy后48小时,实验组细胞平均OD值是对照组细胞的1.1倍。（3）细胞免疫荧光实验表明,突变组GSCs在X射线照射4 Gy后0.5 h γH2AX形成的数目迅速增加,2 h时γH2AX foci量迅速下降,4 h时细胞内γH2AX foci几乎消失,在不同时间突变组胶质瘤干细胞γH2AX foci形成的数目与空载组细胞无显着性差异;（4）流式细胞周期实验显示,质粒转染48 h后,对照组细胞周期各时相所占百分比分别为:G1期72.54%,S期18.14%,G2/M期9.32%;实验组细胞周期各时相所占百分比分别为:G1期65.33%,S期25.23%,G2/M期9.44%;X射线照射后,两组细胞各时相分布百分比无统计学差异;（5）Western blot结果显示,与空载组GSCs比较,突变组GSCs在转染基因突变质粒48小时后TIGAR蛋白表达量未明显下降,经8 Gy X射线照射后2 h,两组细胞TIGAR蛋白表达量上升,与未照射组细胞比较,蛋白增加量的差异具有统计学意义,但两组细胞间增加的蛋白量差异不显着。（6）NADP+/NADPH和GSSG/GSH氧化还原检测试剂盒数据显示数,与空载组细胞相比,突变组细胞内还原性物质有所增加,但两组细胞NADPH/NADP+和GSH/GSSG比值的差异不具有统计学意义。结论:与空载组胶质瘤干细胞相比,IDH1-R132H基因突变未对胶质瘤干细胞造成影响。在X射线照射后,IDH1突变型胶质瘤干细胞的细胞增殖活力、DNA损伤修复效率以及胶质瘤干细胞周期G1,S、G2/M等各个时相的分布均未明显改变;IDH1-R132H基因突变后胶质瘤干细胞内还原性物质NADPH、GSH处于升高趋势,但是IDH1-R132H基因突变的胶质瘤干细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG比值无统计学意义;结果揭示了 IDH1基因突变在胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中的调控机制不同,IDH1突变增加了胶质瘤细胞的放射敏感性,但是对胶质瘤干细胞的放射敏感性无明显影响;这可能是临床上神经胶质瘤对放化疗不敏感,治疗后容易复发的一个主要原因;本课题从IDH1基因突变的放射生物学角度排除了影响GSCs辐射敏感性的一个重要因素,对临床上解释神经胶质瘤的辐射耐受性具有一定的科学意义和应用价值。
薛皓[10]（2016）在《低氧促进胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移过程中相关microRNAs的作用机制研究》文中研究说明研究背景：人脑胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统最常见的颅内原发恶性肿瘤,在所有颅内原发性肿瘤中占到70%左右,其中约50%以上为恶性程度最高的胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme, GBM; WHO IV级）。手术及放化疗等主要的传统治疗方法治愈率低,肿瘤复发率高,患者预后差。近年来,虽然显微手术、新放化疗策略、抗侵袭疗法、抗血管生成疗法和多种基因免疫疗法在人脑胶质瘤等多种恶性肿瘤的治疗研究中取得了长足进步。但由于人脑胶质瘤具有浸润性生长、化疗耐药性、高侵袭性、血管生成拟态以及特殊的免疫抑制性微环境等恶性特征,上述疗法在所有临床实验中均未取得令人满意的效果,患者预后尚无明显改善,中位生存时间仅约12个月,5年生存率不足5%。因此,人们寄希望于对胶质瘤微环境以及细胞恶性行为能力改变机制的深入揭示。其中低氧是实体肿瘤微环境的重要特征之一,参与并调控了肿瘤增殖、侵袭、血管新生及耐药性等一系列变化。因此揭示低氧促进人脑胶质瘤细胞恶性生长、产生耐药性以及侵袭迁移能力的内在机制,并筛选其调控的关键靶点,将为改善胶质瘤的综合疗法提供新的策略。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）是一个具有物理低氧的多因子、多细胞的复杂环境。胶质瘤作为一种典型的实体肿瘤,存在广泛的低氧区域。研究证实,虽然胶质瘤血供较为丰富,但由于增殖代谢旺盛以及血管结构功能异常,各WHO级别的人脑胶质瘤仍存在不同程度的低氧微环境。低级别胶质瘤（WHOⅠ级和Ⅱ级）低氧程度相对较低,其肿瘤内低氧水平约为10%（氧分压）。而高级别胶质瘤低氧水平更为显着,WHO Ⅲ级胶质瘤的氧分压约为2.5～10%,WHOⅣ级胶质瘤的氧分压甚至不足1%。因此,这种强烈的低氧分压微环境作为重要的始动因素之一,显着的影响着胶质瘤细胞的生物学行为,并导致了其对放化疗耐受性的提高,以及增值、侵袭和迁移等能力的改变。同时,严重的低氧微环境也显着改变了微环境中除胶质瘤细胞外的其他各种细胞组分以及所分泌细胞因子的特征。microRNAs （miRs）是一类长约19-22nt的内源性非编码RNA,通过与靶基因3’端非翻译区（3’-UTR）特异性结合并导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译,在转录后水平对基因进行调控,在细胞增殖、凋亡、运动等一系列生物学过程中发挥着重要作用。严重的低氧微环境可以显着影响胶质母细胞瘤中多种miRs的表达,并能通过调控相应下游靶基因发挥重要的作用。其中与肿瘤细胞自噬和细胞运动相关的多个miRs以及其上下游复杂的分子调控机制,可能参与了低氧下胶质母细胞瘤细胞的恶性增殖、耐药性的产生以及侵袭迁移的增强。自噬（Autophagy）是存在于真核生物中一种高度保守的代谢过程：通过回收细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器来自我消化,满足细胞的自身代谢需要和细胞器的再更新。这种回收能量的特殊生存机制在维持细胞正常运转、自我修复、逃避恶劣环境（如饥饿、低氧和毒物药物等）等方面发挥着重要作用。而自噬作为一种新的细胞死亡机制,与凋亡之间存在密切关系,即细胞可在一定程度上通过增强自噬避免凋亡,以帮助细胞抵御恶劣环境。胶质母细胞瘤中存在着广泛的自噬激活现象,显着提高了其对低氧微环境和化疗药物的耐受能力。研究证实低氧是诱导的胶质母细胞瘤自噬增强的重要因素之一,但其具体调控机制仍不清楚。此外,低氧可以显着上调胶质母细胞瘤白细胞介素6 （Interleukin-6,IL-6）的分泌,进而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移等,但IL-6是否参与了低氧诱导的自噬上调以及相关miRs调控网络的作用尚无报道。除了耐药性,人脑胶质母细胞瘤的高侵袭特性也是导致其易复发和致死亡的重要因素之一。侵袭与迁移是肿瘤的重要恶性表型,这一特性受肿瘤微环境中多种因素的调控。细胞极性（Cell Polarity）与肿瘤侵袭转移密切相关,并决定细胞侵袭和迁移的方式。研究发现,低氧可诱导胶质母细胞瘤细胞极性的产生和增强并能促进细胞的侵袭和迁移,而低氧可显着影响调控肿瘤细胞极性的关键分子Rho家族GTP酶的活性。该家族的主要成员包括Rac、RhoA和Cdc42,三者相互配合并顺序激活才能形成有效的细胞迁移,抑制RhoGTP酶通路的活性可导致肿瘤细胞极化和侵袭迁移障碍。越来越多研究证实miRs作为一类重要细胞内调控分子,参与了对细胞运动能力的调节。而低氧诱导的miRs促进胶质母细胞瘤侵袭和迁移的关键调控靶点尚不明确,需要进一步深入研究。本课题分别从低氧诱导的胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移增强等方面,深入系统的探讨了相关的关键调控miRs及其具体分子作用机制。首先,利用基因芯片检测并筛选出了多个调控低氧下胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移的关键miRs靶点；然后,证实了IL-6及其下游miR-155-3p在低氧诱导的胶质母细胞瘤自噬上调中的关键作用,并对抗IL-6受体单克隆抗体（Tocilizumab注射液）的化疗辅助疗效进行了系统评价；最后,深入研究了低氧上调的miR-584-3p在调控胶质母细胞瘤侵袭迁移中的关键作用和具体分子机制。本课题为人脑胶质母细胞瘤的治疗提供了多个针对关键miRs的新靶点,具有重要的理论价值和广阔的应用前景。第一部分低氧下胶质母细胞瘤全基因表达谱和全microRNAs表达谱芯片检测和潜在自噬与侵袭迁移miRs靶点筛选1.1目的：（1）检测低氧对胶质母细胞瘤全基因组表达谱和全microRNAs表达谱的影响,进而联合分析两组芯片数据并筛选与低氧下自噬增强和侵袭迁移变化可能相关的miRs。（2）进一步实验室验证并明确能够显着影响低氧下胶质母细胞瘤细胞自噬和侵袭迁移的miRs。1.2方法：（1）低氧处理、RNA提取和基因芯片检测将低氧处理24h的U251细胞与常氧组对照分别提取总mRNA和总microRNA,通过全基因表达谱和全microRNA表达谱的检测,获取详细结果分析报告和原始数据。（2）两组芯片数据的联合分析和靶点预测筛选经检测芯片数据及样本同质性均较好,使用火山图（Volcano Plot）法筛选出低氧条件下胶质母细胞瘤中表达量变化具有显着性差异的基因和miR s。然后,结合全基因组表达谱芯片报告中的通路分析（P athway Analysis）和GO分析（Gene Ontology Project Analysis）结果以及大量文献阅读,将筛选出的差异性基因和miRs进行关联分析,并进行功能分类,进一步缩小研究范围,找出最有可能调控胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移的miRs。（3）实验室验证所筛选靶点首先,使用多种胶质母细胞瘤细胞系（U251、T98G、U87和A172）进行低氧培养,对筛选出的低氧下变化显着的部分miRs进行实时定量PCR验证。然后,向低氧培养的U251细胞系中瞬时转染相应的microRNA inhibitor和mimics,对通过验证的miRs进行敲除和过表达,分别利用Western blot法、实时定量PCR法、和Transwell法检测上述U251细胞内自噬标记蛋白LC3B分子的表达水平、自噬相关miRs的表达水平、以及迁移能力变化。1.3结果：（1）低氧对胶质母细胞瘤全基因组表达谱和全microRNAs表达量的影响芯片共检测已知基因位点25485个,低氧下上调基因3104个,下调240个；检测已知microRNA位点2137个,低氧下上调157个,下调85个。低氧条件下胶质母细胞瘤U251细胞系的多种mRNA和miR表达量发生了显着改变。（2）联合分析两组芯片数据并筛选与低氧下自噬增强和侵袭迁移变化可能相关的miRs箱图、散点图及聚类分析结果均显示该芯片数据质量可靠,而火山图筛选出2倍以上变化的显着性差异表达的基因和miRs数目明显减少：其中基因有304个,其中上调242个,下调62个；而miRs有84个,其中上调67个,下调17个。然后根据变化倍数对上述靶点进行由大到小排序。对上述差异表达的基因进行Pathway分析发现,富集值较高的通路共6条,其中上调5条,下调1条。而GO分析筛选出上调GO条目218条,下调GO条目87条。结合miRs芯片结果进行联合分析并进行大量文献查阅,按照自噬和侵袭迁移两大功能进行分类,分别筛选出了最有可能调控胶质母细胞瘤自噬的5个miRs以及10个侵袭迁移相关的miRs。（3）进一步实验室验证并明确能够显着影响低氧下胶质母细胞瘤细胞自噬和侵袭迁移的miRs经过进一步低氧胶质母细胞瘤细胞系（U251、T98G、U87和A172）的实时定量PCR验证,最终确定了低氧下表达最具显着差异性的5个miRs（自噬相关的miR-155-3p和miR-224-3p,以及侵袭迁移相关的miR-210、miR-573-5p和miR-584-3p）。通过对低氧培养下5种miRs的敲除和过表达瞬时转染U251细胞系的进一步分子生物学和细胞学实验发现,低氧上调的miR-155-3p和下调的miR-224均可显着影响细胞自噬水平,而侵袭迁移相关的3个上调miRs中仅miR-584-3p能显着改变U251细胞系的迁移能力。此外,IL-6同样可以刺激U251细胞显着上调miR-155-3p。1.4结论：（1）低氧条件可以显着改变胶质母细胞瘤U251细胞的多种基因和miRs的表达水平,其中低氧上调的miR-155-3p和下调的miR-224能显着影响U251细胞自噬水平,而miR-584-3p参与了低氧调控U251细胞系的迁移能力的过程。（2）基因芯片是筛选分子调控靶点的有效工具。1.5创新点：肿瘤低氧微环境是胶质瘤等实体肿瘤最重要的恶性表型之一,本课题通过使用全基因组表达谱芯片对体外低氧培养的胶质母细胞瘤细胞系进行检测,在国际上首次发现了多个与胶质瘤低氧相关的microRNAs分子,并阐明了这些低氧相关的microRNAs的促肿瘤机制（miR-155-3p、miR-224-3p和miR-584-3p的功能均为国际上的首次报道）。第二部分低氧诱导的IL-6和miR-155-3p上调对胶质母细胞瘤自噬水平的影响和机制研究及Tocilizumab的辅助疗效研究2.1目的：（1）在各级别人脑胶质瘤组织标本中检测HIF-1α、IL-6、LC3B以及IL-6效应分子STAT3和p-STAT3的表达并分析其相关性。（2）在体外实验中,利用细胞系和原代胶质瘤细胞,研究低氧对胶质母细胞瘤细胞自噬水平和IL-6的分泌的促进作用,以及外源性和内源性IL-6对胶质母细胞瘤细胞自噬水平的促进作用及相关通路；研究miR-155-3p及其下游通路在低氧诱导IL-6促进自噬过程中的关键作用；研究低氧下IL-6介导的胶质母细胞瘤自噬改变对凋亡水平的影响。（3）在体内实验中,研究IL-6和miR-155-3p敲除对低氧诱导胶质母细胞瘤自噬水平变化和肿瘤生长的影响,并评价IL-6受体单抗Tocilizumab单独应用和与替莫唑胺（TMZ）联用对低氧诱导胶质母细胞瘤自噬水平变化和肿瘤生长的影响及疗效。2.2方法：（1）低氧细胞培养及刺激、RNA和蛋白水平检测对胶质母细胞瘤细胞系和原代胶质瘤细胞进行低氧培养,同时利用外源性IL-6、IL-6阻断抗体、STAT3抑制剂、3-MA、BAF等进行相关刺激,并提取总mRNA和总microRNA用于各相关分子的实时定量PCR检测,或提取总蛋白用于各相关分子的western blot检测。（2）体外实验中的自噬相关检测自噬强度反应指标：倒置荧光显微镜检测带荧光标记自噬蛋白（GFP-LC3B）的U251和T98G细胞中LC3B的荧光强度；Western blot法检测细胞中自噬标记蛋白LC3B-I向Ⅱ的转化和P62的降解；透射电镜法（金标准）检测细胞内自噬小体；3-MA对自噬的抑制和BAF对自噬流的阻断等。（3）细胞转染及荧光素酶报告基因实验分别使用GFP-LC3B质粒、IL-6小干扰RNA、CREB3小干扰RNA、miR-155-3p inhibitor、miR-155-3p mimics、STAT3结合区突变荧光素酶报告基因质粒、miR-155-3p种子序列结合区突变荧光素酶报告基因质粒对U251和T98G细胞进行瞬时转染,用于自噬监测、敲除、过表达、以及荧光素酶报告基因检测。利用IL-6小干扰RNA慢病毒、miR-155-3p inhibitor’慢病毒和miR negative control慢病毒对U251细胞进行稳定转染,用于体内实验皮下成瘤。（4） ELISA检测取不同处理组肿瘤细胞培养上清或动物实验荷瘤小鼠不同治疗组血清进行IL-6的ELISA检测。（5）免疫组织化学染色和免疫荧光染色通过免疫组织化学染色检测：101例各级别人脑胶质瘤组织标本中HIF-1α、 IL-6.LC3B以及IL-6效应分子STAT3和p-STAT3的表达；5例超薄连续切片的高级别胶质母细胞瘤标本中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3的共定位现象；各体内实验的皮下肿瘤中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3、p-STAT3、Ki-67、 Cleaved Caspase-3的表达水平。通过免疫荧光染色检测：5例高级别胶质瘤组织标本切片中IL-6与各类肿瘤低氧微环境中的免疫细胞特异性标记的共定位效应,确定胶质母细胞瘤中IL-6的具体来源分布；以及5例人脑高级别胶质瘤冰冻切片中C REB3.ATG5和LC3免疫荧光共定位效应。（6）细胞活力和凋亡相关检测体外实验中分别使用CCK-8法、以及PI-AnnexinV流式细胞染色法、TUNEL免疫荧光染色法、凋亡相关蛋白caspase3和PARP Western blot法检测常氧和低氧条件下阻断IL-6对胶质母细胞瘤细胞株U251细胞活力和凋亡水平的影响。体内试验中使用免疫组化染色法检测Ki-67和Cleaved Caspase-3的表达水平来反映增殖和凋亡。（7）人脑胶质瘤裸鼠体内皮下成瘤实验通过皮下成瘤体内实验分别研究IL-6和miR-155-3p敲除、IL-6受体单抗Tocilizumab.以及Tocilizumab与替莫唑胺（TMZ）联用对低氧诱导胶质母细胞瘤自噬水平变化（免疫组织化学染色）和肿瘤生长（肿瘤体积测量）的影响。2.3结果：2.3.1人脑胶质瘤组织标本中HIF-1α、IL-6、p-STAT3、LC3B的表达与胶质瘤级别呈正相关101例胶质瘤患者组织标本的免疫组织化学染色结果显示,HIF-1α、IL-6.p-STAT3口LC3B的表达均随胶质瘤级别升高而上调,STAT3表达相对稳定。HIF-1α、IL-6、LC3B、p-STAT3口WHO分级之间均存在着较强的两两正相关性；高级别胶质瘤标本中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3存在明显的共定位效应,且围绕血管周边低氧区呈环形分布；高级别胶质瘤标本的免疫荧光共定位染色发现约80%的IL-6来源于胶质瘤细胞的自分泌和旁分泌,各种IL-6分泌型免疫细胞仅占20%左右。2.3.2低氧显着上调胶质母细胞瘤细胞的自噬水平和IL-6分泌GFP-LC3B荧光结果和Western blot结果均显示U251和T98G细胞的自噬水平在低氧下显着上调,且3-MA能抑制该自噬上调,而BAF自噬流阻断实验证实低氧下U251和T98G细胞自噬流通畅。ELISA法检测发现U251和T98G细胞低氧下IL-6的分泌显着增加。2.3.3外源性和内源性IL-6均能通过p-STAT3通路显着上调胶质母细胞瘤细胞自噬水平GFP-LC3B免疫荧光、western blot和透射电镜结果均发现常氧条件下外源性IL-6处理的U251和T98G细胞自噬水平均显着上调；使用抗体阻断或小干扰RNA敲除IL-6能够显着抑制IL-6和低氧诱导的自噬；GFP-LC3B免疫荧光和western blot结果还发现IL-6通过上调STAT3的磷酸化水平来激活自噬,阻断IL-6能够显着降低STAT3的磷酸化水平和自噬水平。2.3.4低氧诱导的IL-6/p-STAT3通路通过上调miR-155-3p的表达来促进胶质母细胞瘤细胞自噬水平实时定量PCR结果显示低氧下miR-155-3p表达量显着上调并具有时间依赖性,且外源性IL-6也能够促进U251细胞中miR-155-3p的表达,而IL-6阻断剂处理的U251细胞中miR-155-3p的表达量显着下调；p-STAT3抑制剂处理的U251和T98G细胞中miR-155-3p的表达量显着下调；进一步通过荧光素酶报告基因实验证实,p-STAT3能够对miR-155-3p的表达进行直接调控；GFP-LC3B免疫荧光和western blot结果均发现,在常氧和低氧条件下使用miR-155-3p inhibitor进行miR的敲除能够显着下调U251的自噬水平,且miR-155-3p inhibitor能够阻断IL-6对自噬的促进作用；而使用miR-155-3p mimics进行miR的过表达能够显着上调U251的自噬水平,且miR-155-3p mimics能够显着提高IL-6阻断抗体和IL-6小干扰RNA处理U251细胞的自噬水平。2.3.5 miR-155-3p调控胶质母细胞瘤细胞自噬水平的具体分子靶点和机制以及低氧诱导自噬的完整信号通路miRbase的miR-155-3p直接结合靶点预测结果显示,CREBRF是miR-155-3p的最佳靶分子,3’UTR区域中存在三个结合力较高的种子序列；荧光素酶报告基因结果证实CREBRF为miR-155-3p的直接靶点；Western blot验证发现miR-155-3p过表达能显着下调CREBRF蛋白水平,并上调CREBRF下游负向调控靶分子CREB3的表达；敲除U251和T98G细胞中的CREB3能显着抑制自噬,且自噬相关蛋白ATG5为CREB3促进自噬现象的效应分子；通过对人脑高级别胶质瘤冰冻切片进行CREB3、ATG5和LC3免疫荧光共定位染色发现,三者具有显着的共定位关系。综上所述,胶质母细胞瘤中“低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/ CREB3/ATG5/LC3B/自噬”这一完整信号通路的体外实验验证完成（同时使用原代胶质母细胞瘤进行了重复验证）。2.3.6低氧诱导的IL-6通过上调胶质母细胞瘤自噬水平抑制其凋亡CCK-8法检测发现低氧下阻断IL-6能降低U251的细胞活力；而通过PI-AnnexinV流式细胞染色法、TUNEL法和Western blot法检测均发现低氧条件下阻断IL-6能够显着提高U251细胞的凋亡水平。2.3.7体内实验中敲除IL-6和miR-155-3p能抑制低氧诱导的胶质母细胞瘤自噬并抑制肿瘤生长人胶质瘤荷瘤裸鼠异位模型结果显示IL-6小干扰RNA和miR-155-3p inhibitor均可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长；免疫组化法结果显示IL-6敲除的皮下肿瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3和Ki-67显着下降,Cleaved Caspase-3的水平升高,而miR-155-3p敲除的皮下肿瘤中IL-6未受显着影响,但下游LC3B、p-STAT3和Ki-67显着下降,Cleaved Caspase-3的水平升高。2.3.8体内实验中IL-6单抗Tocilizumab通过阻断胶质母细胞瘤自噬通路抑制肿瘤生长Tocilizumab能够抑制胶质母细胞瘤的生长,并能够显着降低荷瘤小鼠血液内的IL-6水平（p<0.05）；免疫组织化学结果显示Tocilizumab治疗组的皮下肿瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3、Ki-67水平显着下降,Cleaved Caspase-3的表达水平显着上调。2.3.9体内实验证实IL-6单抗Tocilizumab与替莫唑胺（TMZ）联用可提高后者疗效Tocilizumab注射液和TMZ均可显着抑制胶质母细胞瘤生长,Tocilizumab能够显着促进TMZ的疗效（p<0.05）；免疫组织化学染色结果显示,与前面体内实验结果一致Tocilizumab能显着下调皮下肿瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3、和Ki-67水平,并上调Cleaved Caspase-3的表达水平。TMZ治疗组IL-6、LC3B、p-STAT3水平显着上调,而Tocilizumab能够显着抑制TMZ对IL-6、LC3B、p-STAT3的上调,并进一步上调Cleaved Caspase-3的表达水平。2.4结论：（1）各级别人脑胶质瘤组织标本中HIF-1α、IL-6、LC3B、p-STAT3和WHO分级之间存在着较强的正相关性,其中高级别胶质母细胞瘤中IL-6来源以胶质瘤细胞自身为主,其它多种免疫间质细胞也有部分分泌。首次证实高级别胶质母细胞瘤血管周环形低氧区中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3存在明显的共定位效应。（2）体外实验结果证实,低氧条件下胶质母细胞瘤自噬上调是通过“低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/CREB3/ATG5/LC3B/自噬”这一全新完整信号通路实现的,揭示了IL-6在该过程中重要的始动作用。通过IL-6阻断抗体抑制IL-6的促自噬作用能够促进胶质母细胞瘤凋亡,提示了IL-6抗体潜在的治疗价值。（3）通过进一步体内实验证实,IL-6和miR-155-3p敲除可显着降低低氧诱导胶质母细胞瘤自噬并抑制肿瘤生长,而IL-6单抗Tocilizumab也能够降低低氧诱导胶质母细胞瘤自噬,促进凋亡,抑制肿瘤生长,并显着提高了替莫唑胺（TMZ）的抑瘤疗效。这些结果为抗关节炎新药Tocilizumab在胶质母细胞瘤辅助治疗中的临床应用提供了重要的依据。2.5创新点：（1）在国际上首次提出并证实了IL-6是介导低氧下胶质母细胞瘤自噬的关键启动因子,并首次报道了这种IL-6促进实体肿瘤恶性进展的新机制。（2）在国际上首次发现并报道了IL-6促进低氧肿瘤细胞自噬的完整分子通路（低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/CREB3/ATG5/LC3B/自噬）,其中p-STAT3对miR-155-3p的直接调控机制、miR-155-3p对CREBRF的直接调控机制、和CREB3对ATG5调控机制均为国际上的首次报道,均具有非常强的创新性。（3）在国际上首次提出了处于肿瘤血管周围低氧区中的胶质瘤细胞通过上调IL-6自分泌和旁分泌提高自身自噬水平,从而抑制凋亡,促进肿瘤恶性进展的新假说,并加以阐明。（4）在国际上首次利用IL-6单克隆抗体Tocilizumab进行胶质瘤辅助治疗的动物实验,发现了Tocilizumab注射液在治疗风湿性关节炎之外的抗胶质瘤作用,并首次证实了Tocilizumab通过阻断IL-6诱导的自噬并促进凋亡的抗胶质瘤作用机制。（5）更重要的是,由于现有临床上唯一批准的抗胶质瘤化疗药物替莫唑胺（TMZ）存在极高的耐药率,而这种耐药率的产生与替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞保护性自噬有密切关系,我们首次发现Tocilizumab与替莫唑胺联合应用能显着抑制这种自噬依赖的耐药性,大大提高替莫唑胺的抑瘤疗效,具有重要的临床应用价值和潜在的社会经济效益。第三部分miR-584-3p对低氧条件下人脑胶质母细胞瘤的侵袭和迁移能力的影响及机制研究3.1目的：（1）检测各WHO级别人脑胶质瘤组织标本中miR-584-3p的表达水平与其靶分子ROCK1的表达相关性,并结合胶质瘤患者的病例随访结局研究miR-584-3p的表达水平与术后生存期的关系。（2）在体外实验中研究miR-584-3p对低氧下胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移能力、细胞骨架的影响及其直接靶点和分子机制。（3）通过体内实验研究miR-584-3p对胶质母细胞瘤侵袭迁移能力的影响。3.2方法：（1）低氧细胞培养及刺激、RNA和蛋白水平检测对U251和U87细胞进行低氧处理,结合各种转染或ROCK1抑制剂Y27632等相关刺激后,提取总mRNA和总microRNA用于各相关分子的实时定量PCR检测,或提取总蛋白用于各相关分子的western blot检测。（2）侵袭迁移相关检测和细胞骨架荧光染色通过使用常氧和低氧条件下的12h划痕实验、24h Transwell迁移实验、和24h Matrigel基质胶侵袭迁移实验检测各实验组U251和U87细胞迁移侵袭能力的变化。使用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞爬片上的细胞进行细胞骨架免疫荧光染色,观察细胞骨架中张力纤维的改变。（3）细胞转染及荧光素酶报告基因实验分别使用miR-584-3p inhibitor、miR-584-3p mimics、miR-584-5p inhibitor、miR-584-5p mimics、ROCK1、干扰RNA. miR-584-3p种子序列结合区突变荧光素酶报告基因质粒对U251和U87细胞进行瞬时转染,用于敲除、过表达、以及荧光素酶报告基因检测。利用miR-584-3p inhibitor、miR-584-3p mimics’慢病毒和miR negative control慢病毒对U87细胞进行稳定转染,用于体内实验颅内原位成瘤。（4）组织标本中的免疫组织化学染色与实时定量PCR检测选取26例各级别人脑胶质瘤组织标本,通过免疫组织化学染色检测组织标本中ROCK1的表达,同时提取总RNA后使用实时定量PCR法检测标本中miR-584-3p的表达水平,并将结果进行相关分析。（5）生存分析对26例胶质瘤患者进行随访,随访结局为患者是否死亡并记录死亡时间。根据患者手术标本中的miR-584-3p的表达水平,分为高表达组和低表达组,并进行Kaplan-Meier生存分析。（6）颅内原位成瘤实验利用稳定转染的U87细胞建立人胶质瘤荷瘤裸鼠颅内原位模型（立体定向仪接种）,随机分为miR-584-3p mimics、miR-584-3p inhibitor和negative control三组。通过磁共振定期测量颅内肿瘤的大小,观察miR-584-3p对胶质母细胞瘤生长的影响。同时通过HE染色法检测颅内肿瘤边界和浸润情况,反应胶质瘤的侵袭能力变化。并使用免疫组织化学法检测miR-584-3p对胶质母细胞瘤中ROCK1的影响。3.3结果：3.3.1低氧能够上调人脑胶质母细胞瘤细胞中miR-584-3p表达水平实时定量PCR结果表明低氧下U251和U87细胞中的miR-584-3p显着上调,并在24h左右达到高峰。3.3.2人脑胶质瘤组织标本中miR-584-3p的表达水平随WHO级别而升高实时定量PCR检测26例不同WHO级别的新鲜人脑胶质瘤组织标本发现,miR-584-3p的表达水平与级别有关,高级别胶质瘤患者（WHO Ⅲ口Ⅳ级）的miR-584-3p的表达水平显着高于低级别胶质瘤患者（WHO Ⅰ和Ⅱ级）（p<0.05）。高级别胶质瘤患者（WHO Ⅲ口Ⅳ级）的miR-584-3p的表达水平（4.4±3.9）组内差异较大。3.3.3高表达miR-584-3p的高级别胶质瘤患者术后生存期显着延长高级别胶质瘤患者（WHO Ⅲ和Ⅳ级）术后一年生存率为53.3%,其中miR-584-3p高表达组的高级别胶质瘤患者术后1年生存率为75%,而miR-584-3 p低表达组的高级别胶质瘤患者术后1年生存率仅为28.6%（p=0.03）。3.3.4 miR-584-3p敲除能够显着促进低氧下胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移常氧和低氧条件下的12h划痕实验和24h Transwell迁移实验发现miR-584-3p inhibitor瞬时转染能够显着增强U251和U87细胞的迁移能力；Matrigel基质胶侵袭迁移实验也发现miR-584-3p inhibitor瞬时转染能够显着增强U251和U87细胞的侵袭能力。3.3.5miR-584-3p过表达能显着抑制低氧下胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移常氧和低氧条件下的12h划痕实验和24h Transwell迁移实验检测发现miR-584-3p mimics瞬时转染能够显着抑制U251和U87细胞的迁移能力；Matrigel基质胶侵袭迁移实验也发现miR-584-3p mimics瞬时转染能显着抑制U251口U87细胞的侵袭能力。3.3.6 miR-584-3 p通过调控低氧下胶质母细胞瘤细胞骨架重构抑制侵袭迁移细胞骨架荧光染色发现,低氧下的U251细胞形态明显伸长,极性增加,细胞骨架中张力纤维呈明显的束状聚集并贯穿与细胞的长轴,而miR-584-3p敲除能够显着增强U251细胞的极性和张力纤维的束状聚集；miR-584-3p过表达能够消除常氧和低氧下的U251细胞极性,细胞呈圆形形态,细胞骨架中张力纤维束状聚集现象消失,并高度聚集于细胞皮层下。3.3.7 miR-584-3p通过直接靶向ROCK1调控低氧下胶质母细胞瘤侵袭迁移能力根据细胞骨架张力纤维变化,检测其关键调控分子ROCK1发现,miR-584-3p能够显着改变ROCK1的表达；而划痕实验和Transwell实验均发现ROCK1抑制剂Y27632和ROCK1小干扰RNA均能够阻断miR-584-3p对胶质母细胞瘤侵袭迁移能力调控作用；荧光素酶报告基因实验结果证实,ROCK1为miR-584-3p的直接靶点,并通过Western blot进行了验证。3.3.8各WHO级别人脑胶质瘤组织标本中miR-584-3p与ROCK1的表达呈负相关26例人脑胶质瘤组织标本的ROCK1免疫组织化学染色结果显示,ROCK1的表达水平与miR-584-3p的表达水平呈负相关,Spearman相关系数为-0.7,p<0.01。3.3.9体内实验中过表达miR-584-3p能显着抑制胶质母细胞瘤侵袭迁移能力并延长生存期人胶质瘤荷瘤裸鼠颅内原位模型研究发现miR-584-3p过表达组颅内肿瘤边界相对清晰和浸润较少,胶质瘤的侵袭能力受到抑制,而miR-584-3p敲除组颅内肿瘤边界不清和浸润较为明显,胶质瘤的侵袭能力显着增强；ROCK1免疫组织化学染色发现miR-584-3p能够抑制体内实验的胶质母细胞瘤中ROCK1的表达；此外,miR-584-3p过表达组荷瘤小鼠生存期显着延长,而敲除组显着缩短。3.4结论：（1）虽然高级别胶质瘤患者（WHO III和Ⅳ级）的miR-584-3p的表达水平显着高于低级别胶质瘤患者（WHO Ⅰ和Ⅱ级）,但组内差异性大。其中,miR-584-3p高表达的高级别胶质瘤患者术后1年生存率较低表达患者显着提高,提示miR-584-3p具有抑癌作用,并能够作为胶质母细胞瘤预后的标记。低氧诱导人脑胶质母细胞瘤细胞中miR-584-3p的表达升高为反应性保护性上调。（2）体外实验和体内实验均证实,miR-584-3p能够通过直接靶向抑制ROCK1依赖的细胞骨架重构,从而显着抑制低氧下胶质母细胞瘤细胞的侵袭迁移能力,减少肿瘤浸润性生长,并限制肿瘤大小,延长生存期。提示miR-584-3p可以作为胶质母细胞瘤抗侵袭治疗的潜在干预靶点,具有重要的学术意义和应用价值。3.5创新点：（1）在国际上首次发现了并报道了miR-584-3p的生物学功能,即抑制低氧下胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭的作用,并证实了其直接靶点之一是,ROCK1。（2）在国际上首次发现并报道了人脑胶质瘤患者标本中miR-584-3p的表达水平与预后生存期的关系,提供了miR-584-3p是一个重要的抑癌基因,也是一个良好的预后预测标记的直接证据。
二、抗人脑胶质瘤单克隆抗体H_(12)的荧光标记（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗人脑胶质瘤单克隆抗体H_(12)的荧光标记（论文提纲范文）
（1）改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型及隐丹参酮治疗脑瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 第一部分 改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 慢病毒法构建双荧光标记稳定转染细胞株结果 |
| 2.2 稳定转染株细胞与原始株细胞增殖、迁移、侵袭能力评估结果 |
| 2.3 稳定转染株细胞体外发光检测结果 |
| 2.4 术后裸鼠行为、体质量及生存情况观察结果 |
| 2.5 活体成像检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 隐丹参酮治疗脑瘤的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CTS对 U87 细胞DR4、DR5和STAT3 表达的时效、量效关系 |
| 2.2 CTS与 TRAIL单独或联合应用对U87 细胞存活率的影响 |
| 2.3 CTS与 TRAIL单独或联合应用对U87 细胞凋亡的影响 |
| 2.4 CTS与 TRAIL联用对U87 细胞caspase家族及STAT3 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 联合用药逆转胶质瘤对 TRAIL 耐药的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（2）紫草素/双硫仑仿生递药系统的构建及脑胶质瘤治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脑胶质瘤的研究现状 |
| 1.2 脑胶质瘤免疫疗法研究进展 |
| 1.3 传统中医药在治疗肿瘤上的独特优势 |
| 1.4 双硫仑概述 |
| 1.5 肿瘤细胞能量代谢的替代途径 |
| 1.6 基于营养转运蛋白的仿生脑靶向策略 |
| 1.6.1 基于白蛋白的仿生递药 |
| 1.6.2 基于乳铁蛋白的仿生递药 |
| 第二章 目标代谢酶基因表达的生信分析与联合治疗方案的优化 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 仪器及试剂 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 基因表达差异分析 |
| 2.2.2 基因表达与生存状态相关性分析 |
| 2.2.3 胶质瘤细胞系和正常脑细胞系基因表达差异 |
| 2.2.4 肿瘤组织和正常组织中蛋白表达差异验证 |
| 2.2.5 DSF和SHK的酶抑制活性 |
| 2.2.6 联合治疗最佳比例确定 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 实验结果及讨论 |
| 2.3.1 基因表达差异及其与生存状态相关性分析 |
| 2.3.2 表达差异在小鼠胶质瘤组织上的验证 |
| 2.3.3 肿瘤细胞系上验证DSF和SHK的代谢酶抑制活性 |
| 2.3.4 最佳联合用药比例的确定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 仿生递药策略设计及白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的制备和表征 |
| 3.1 仪器与材料 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 细胞系 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Cy5-BSA与Cy5-LF合成与纯化 |
| 3.2.2 纳米粒(未载药)制备 |
| 3.2.3 纳米载体的体内药动学研究 |
| 3.2.4 纳米载体的体内靶向性研究 |
| 3.2.5 体外药物分析方法的确立 |
| 3.2.6 白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的制备 |
| 3.2.7 纳米粒的表征 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 3.3 实验结果及讨论 |
| 3.3.1 仿生递药策略设计 |
| 3.3.2 药物的体外分析方法 |
| 3.3.3 纳米粒的影响因素 |
| 3.3.4 BOX-Behnken试验优化纳米粒处方 |
| 3.3.5 纳米粒的表征 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的体外抗肿瘤研究 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 材料和试剂 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 细胞系 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞摄取实验 |
| 4.2.2 肿瘤细胞增殖抑制实验 |
| 4.2.3 药物诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡 |
| 4.2.4 免疫原性细胞死亡刺激树突状细胞成熟 |
| 4.2.5 免疫原性细胞死亡激活T细胞免疫 |
| 4.2.6 乳酸抑制DC细胞成熟和T细胞免疫激活 |
| 4.2.7 嵌合纳米粒调控M2型巨噬细胞 |
| 4.2.8 纳米粒调控肿瘤细胞的能量代谢 |
| 4.2.9 统计分析 |
| 4.3 实验结果及讨论 |
| 4.3.1 细胞摄取 |
| 4.3.2 肿瘤细胞增殖抑制活性 |
| 4.3.3 药物诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡 |
| 4.3.4 免疫原性细胞死亡刺激树突状细胞成熟 |
| 4.3.5 免疫原性细胞死亡激活T细胞免疫 |
| 4.3.6 乳酸抑制DC成熟和T细胞免疫 |
| 4.3.7 纳米粒调控M2型巨噬细胞 |
| 4.3.8 纳米粒调控肿瘤细胞的能量代谢 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的体内药效学研究 |
| 5.1 材料和仪器 |
| 5.1.1 材料和试剂 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 细胞系 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 BSA/LFNP体内分布 |
| 5.2.2 肿瘤组织内纳米粒与营养转运蛋白共定位 |
| 5.2.3 药物组织内分布 |
| 5.2.4 体内药效学研究 |
| 5.2.5 肿瘤组织中免疫细胞亚群检测 |
| 5.2.6 肿瘤组织中乳酸和ATP检测 |
| 5.2.7 肿瘤代谢和免疫互动调控验证 |
| 5.2.8 统计分析 |
| 5.3 实验结果及讨论 |
| 5.3.1 体内分布 |
| 5.3.2 脑组织中纳米粒与营养转运蛋白的共定位 |
| 5.3.3 药物在肿瘤组织内分布 |
| 5.3.4 体内药效学研究 |
| 5.3.5 肿瘤组织中的免疫细胞分析 |
| 5.3.6 肿瘤组织中的ATP水平变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 仿生白蛋白递药系统治疗耐药非小细胞肺癌脑转移 |
| 6.1 材料和仪器 |
| 6.1.1 试剂与材料 |
| 6.1.2 仪器 |
| 6.1.3 细胞系 |
| 6.1.4 实验动物 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 联合治疗方案的优化 |
| 6.2.2 纳米粒制备与表征 |
| 6.2.3 体外细胞实验 |
| 6.2.4 纳米粒的体内分布 |
| 6.2.5 纳米粒的体内药效及抗肿瘤机制研究 |
| 6.2.6 巨噬细胞介导的抗耐药疗法 |
| 6.2.7 统计分析 |
| 6.3 实验结果及讨论 |
| 6.3.1 耐药性验证级最佳联用比例的确定 |
| 6.3.2 纳米粒的表征 |
| 6.3.3 细胞摄取研究 |
| 6.3.4 体外抗肿瘤活性 |
| 6.3.5 药物对巨噬细胞表型和功能的调控 |
| 6.3.6 体内分布 |
| 6.3.7 肿瘤组织内纳米粒与营养转运蛋白共定位 |
| 6.3.8 皮下瘤模型体内药效学及抗肿瘤机制研究 |
| 6.3.9 脑转移瘤模型的药效学及抗肿瘤机制研究 |
| 6.3.10 安全性初步评价 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论及创新性分析 |
| 7.1. 全文讨论 |
| 7.2. 创新性分析 |
| 7.3. 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 符号/缩略词说明 |
| 附录二 研究涉及的溶液/试剂配方 |
| 附录三 Western blot及定磷法具体步骤 |
| 附录四 药物组织分布方法学研究 |
| 附录五 脑胶质瘤和正常脑组织中ALDH1L1及PKM2表达数据 |
| 附录六 脑胶质瘤患者ALDH1L1表达及生存期数据 |
| 附录七 脑胶质瘤患者PKM2表达及生存期数据 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）TSP2在胶质瘤相关癫痫中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤相关癫痫的现状 |
| 1.1.1 癫痫概述 |
| 1.1.2 肿瘤相关癫痫患者的预后 |
| 1.2 肿瘤相关癫痫的病理生理机制 |
| 1.2.1 肿瘤因素 |
| 1.2.2 瘤周因素 |
| 1.3 TSP与突触重塑 |
| 1.3.1 TSP的结构和生理作用 |
| 1.3.2 TSP在神经系统中的病理生理作用 |
| 1.3.3TSP与α2δ1 |
| 1.3.4 TSP与 Gabapentin |
| 1.4 课题研究的目的及主要内容 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 课题研究目的 |
| 1.4.3 本研究创新点 |
| 1.4.4 本研究主要内容 |
| 1.4.5 本研究技术路线 |
| 第2章 大鼠脑胶质瘤相关癫痫放电模型的构建及评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 C6胶质瘤细胞培养 |
| 2.2.2 SD大鼠C6脑胶质瘤模型构建 |
| 2.2.3 C6/SD模型脑组织HE染色 |
| 2.2.4 C6/SD模型脑组织免疫组化染色 |
| 2.2.5 神经功能损伤评分 |
| 2.2.6 模型大鼠在体皮层脑电监测 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大体病理解剖和HE染色 |
| 2.3.2 免疫组化染色 |
| 2.3.3 NSS评分 |
| 2.3.4 在体皮层脑电监测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 TSP2在模型大鼠瘤周皮层中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床标本 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 临床患者标本准备 |
| 3.2.2 C6胶质瘤细胞培养 |
| 3.2.3 皮层胶质瘤模型构建 |
| 3.2.4 Western Blot |
| 3.2.5 免疫荧光染色 |
| 3.2.6 免疫组化染色 |
| 3.2.7 高尔基染色 |
| 3.2.8 透射电镜 |
| 3.2.9 在体皮层脑电记录 |
| 3.2.10 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 术中皮层脑电和动物模型瘤周痫样放电 |
| 3.3.2 TSP2在人体和动物模型肿瘤标本中的表达 |
| 3.3.3 突触素蛋白在模型大鼠瘤周的表达 |
| 3.3.4 人体胶质瘤瘤周和动物模型瘤周兴奋性突触表达 |
| 3.3.5 人体胶质瘤瘤周和动物模型瘤周抑制性突触表达 |
| 3.3.6 瘤周神经元形态和突触棘密度 |
| 3.3.7 瘤周突触超微结构变化 |
| 3.3.8 瘤周皮层脑电变化 |
| 3.3.9 TSP2可部分来源于瘤周反应性星形胶质细胞 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 TSP2促进兴奋性突触生成的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Western Blot |
| 4.2.2 免疫荧光染色 |
| 4.2.3 Gabapentin的干预作用 |
| 4.2.4 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 α2δ1在C6移植模型中的表达 |
| 4.3.2 Rac1在C6移植模型中的表达 |
| 4.3.3 ERK在C6移植模型中的表达 |
| 4.3.4 Gabapentin对瘤周放电的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）蒿甲醚体外抗舌鳞癌的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 蒿甲醚抑制舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 蒿甲醚通过下调HSP90/AKT途径抑制舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 蒿甲醚通过miR-29a-3p/AKT3通路抑制舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA29在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）不同级别人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠异种皮下移植瘤模型的建立及其生物学特征（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 不同级别人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠异种皮下移植瘤模型的建立及其生长特性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 成功建立的胶质瘤PDX模型与胶质瘤患者IDH1 野生型和Ki67 表达量高于5%呈正相关 |
| 2.2 不同级别胶质瘤PDX移植成功率在33.33%-87.5%间波动 |
| 2.3 胶质瘤PDX移植瘤P2-P5代相对于原发胶质瘤潜伏期更短,生长速度显着加快 |
| 2.4 PDX肿瘤复制了人胶质瘤患者弥漫侵袭性生长特性 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 人源性胶质瘤PDX模型的鉴定及其生物学特征 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 移植瘤显示出对应患者胶质瘤的组织学特征和免疫表型 |
| 2.2 移植瘤中人源性血管逐渐被鼠源性新生血管所取代 |
| 2.3 移植瘤和患者胶质瘤保持高度的IDH突变状态和基因相似性 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
（6）脑靶向siPD-L1和替莫唑胺共递送系统的构建及其抗耐药脑胶质瘤活性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 共载siPD-L1 和替莫唑胺脂质聚合物纳米粒的构建及其表征 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 细胞与动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PASP-g-PEI的合成及结构表征 |
| 2.2 Glu-PEG-DSPE的合成及表征 |
| 2.3 共载siPD-L1 和替莫唑胺脂质聚合物纳米粒的制备及表征 |
| 2.4 材料的安全性评价 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PASP-g-PEI的表征 |
| 3.2 Glu-PEG-DSPE的表征 |
| 3.3 负载siPD-L1 聚合物纳米粒的表征 |
| 3.4 共载siPD-L1 和替莫唑胺脂质聚合物纳米粒的表征 |
| 3.5 材料安全性评价 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 共载siPD-L1 和替莫唑胺脂质聚合物纳米粒体外抗耐药脑胶质瘤活性及其跨细胞膜转运 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 耐TMZ脑胶质瘤细胞株的构建 |
| 2.3 siPD-L1 碱基对序列活性筛选 |
| 2.4 脂质聚合物纳米粒的基因沉默作用 |
| 2.5 脂质聚合物纳米粒体外抗耐药脑胶质瘤活性 |
| 2.6 脂质聚合物纳米粒对C6/TR细胞中MGMT表达的影响 |
| 2.7 耐药脑胶质瘤细胞以及RAW264.7 细胞对脂质聚合物纳米粒的摄取 |
| 2.8 脂质聚合物纳米粒穿透体外血脑屏障的效率 |
| 2.9 脂质聚合物纳米粒在体外3D脑胶质瘤C6/TR细胞球内的分布 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TMZ对 C6细胞、C6/TR细胞、C6-luc细胞及C6-luc/TR细胞的细胞毒性 |
| 3.2 不同siPD-L1 序列对C6/TR细胞中PD-L1 的沉默作用 |
| 3.3 脂质聚合物纳米粒对目标基因的沉默作用 |
| 3.4 脂质聚合物纳米粒的体外抗耐药脑胶质瘤活性 |
| 3.5 脂质聚合物纳米粒对C6/TR细胞中MGMT表达的影响 |
| 3.6 脑胶质瘤细胞以及RAW264.7 细胞对脂质聚合物纳米粒的摄取 |
| 3.7 脂质聚合物纳米粒跨体外血脑屏障的转运效率 |
| 3.8 脂质聚合物纳米粒在体外3D脑胶质瘤C6/TR细胞球内的分布 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 共载siPD-L1 和替莫唑胺脂质聚合物纳米粒的体内分布及抗耐药脑胶质瘤活性 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 动物和细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 C6-luc细胞及C6/TR-luc细胞原位脑胶质瘤模型的建立 |
| 2.2 脂质聚合物纳米粒在原位脑胶质瘤小鼠及正常小鼠体内的分布 |
| 2.3 脂质聚合物纳米粒中TMZ在小鼠体内的药物动力学和组织分布 |
| 2.4 脂质聚合物纳米粒体内抗脑胶质瘤活性 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脂质聚合物纳米粒在原位脑胶质瘤小鼠及正常小鼠体内的分布 |
| 3.2 脂质聚合物纳米粒在脑胶质瘤组织内的分布 |
| 3.3 脂质聚合物纳米粒中TMZ在小鼠体内的药物动力学和组织分布 |
| 3.4 脂质聚合物纳米粒对TMZ敏感和耐TMZ原位脑胶质瘤的治疗作用 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历及研究成果 |
| 致谢 |
（7）RACK1在脑缺血再灌注损伤中的作用及作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 主要抗体和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验设计和分组 |
| 2.2 大鼠MCAO/R模型的建立 |
| 2.3 原代神经元的提取和培养 |
| 2.4 神经元OGD/R模型的建立 |
| 2.5 大鼠脑组织标本的制备 |
| 2.6 Western Blot试验 |
| 2.7 免疫共沉淀试验 |
| 2.8 石蜡切片的免疫荧光染色试验 |
| 2.9 神经元的免疫荧光染色试验 |
| 2.10 过表达质粒的构建和点突变 |
| 2.11 过表达质粒的体内外转染 |
| 2.12 TTC染色及梗塞程度的评估 |
| 2.13 脑水肿的检测 |
| 2.14 FJB染色 |
| 2.15 Tunel染色 |
| 2.16 LDH检测 |
| 2.17 Hoechst染色 |
| 2.18 水迷宫试验 |
| 2.19 神经元核糖体蛋白的提取 |
| 2.20 统计分析 |
| 结果 |
| 1. 大鼠总体存活率 |
| 2. 半暗带组织中RACK1蛋白水平的变化 |
| 3. RACK1蛋白的细胞种类定位 |
| 4. 半暗带组织中RACK1蛋白磷酸化水平的变化及其抑制剂 |
| 5. 过表达质粒转染后外源性野生型GFP-RACK1和T50突变型GFP-RACK1的蛋白水平的变化及其磷酸化的变化 |
| 6. 外源性野生型GFP-RACK1蛋白和T50突变型GFP-RACK1蛋白对MCAO/R及OGD/R的早期影响 |
| 7. 外源性野生型GFP-RACK1蛋白和T50突变型GFP-RACK1蛋白对MCAO/R的晚期影响 |
| 8. RACK1蛋白的细胞亚定位及其在OGD/R后的蛋白分布及水平的变化 |
| 9. 外源性野生型GFP-RACK1蛋白和T50突变型GFP-RACK1蛋白的细胞亚定位及其在OGD/R后的蛋白分布及水平的变化 |
| 10. 外源性野生型GFP-RACK1蛋白和T50突变型GFP-RACK1蛋白与Beclin-1的相互作用 |
| 11. 外源性野生型GFP-RACK1蛋白和T50突变型GFP-RACK1蛋白调控自噬水平 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 活化的蛋白激酶C1受体在神经系统中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读硕士期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（8）TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制和多基因风险评分的预后价值（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一部分 肿瘤相关巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 TAM-GBM细胞杂交的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 TAM-GBM杂交细胞的转录组特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 TAM-GBM细胞杂交对胶质母细胞瘤侵袭的影响及机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第二部分 多基因风险评分在胶质母细胞瘤中的预后价值 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 胶质母细胞瘤多基因风险评分模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 多基因风险评分在胶质母细胞瘤中的预后价值评估 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞杂交在肿瘤发生发展中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）IDH1突变对胶质瘤干细胞辐射敏感性的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 IDH1突变胶质瘤干细胞的构建 |
| 一、胶质瘤干细胞的培养,分选及鉴定 |
| (一) 胶质瘤干细胞的培养 |
| (二) 胶质瘤干细胞的分选 |
| (三) 胶质瘤干细胞的鉴定 |
| 二、构建IDH1-R132H基因过表达的胶质瘤干细胞 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IDH1突变对胶质瘤干细胞辐射敏感性的影响 |
| (一) X射线对IDH1-R132H基因突变GSCs细胞克隆形成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (二) X射线对IDH1-R132H突变GSCs细胞活力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (三) X射线对IDH1-R132H突变GSCs γH2AX foci的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (四) X射线对IDH1-R132H突变GSCs细胞周期的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (五) 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IDH1调节TIGAR蛋白影响GSCs辐射抗性的机制研究 |
| (一) IDH1-R132H对NADPH/NADP~+比值的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (二) IDH1-R132H对GSH/GSSG比值的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (三) IDH1-R132H突变GSCs的TIGAR蛋白表达水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 中英文缩略词对照 |
| 致谢 |
（10）低氧促进胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移过程中相关microRNAs的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分：低氧下胶质母细胞瘤全基因表达谱和全microRNAs表达谱芯片检测和潜在自噬与侵袭迁移miRs靶点筛选 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分：低氧诱导的IL-6和miR-155-3p上调对胶质母细胞瘤自噬水平的影响和机制研究及Tocilizumab的辅助疗效研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分：miR-584-3p对低氧条件下人脑胶质母细胞瘤的侵袭和迁移能力的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
四、抗人脑胶质瘤单克隆抗体H_(12)的荧光标记（论文参考文献）
- [1]改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型及隐丹参酮治疗脑瘤的研究[D]. 赵峰. 桂林医学院, 2021(01)
- [2]紫草素/双硫仑仿生递药系统的构建及脑胶质瘤治疗的研究[D]. 赵鹏飞. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]TSP2在胶质瘤相关癫痫中的作用机制研究[D]. 王耀辉. 西南交通大学, 2020
- [4]蒿甲醚体外抗舌鳞癌的作用和机制研究[D]. 吴剑花. 昆明医科大学, 2020(02)
- [5]不同级别人脑胶质瘤患者源性NPG小鼠异种皮下移植瘤模型的建立及其生物学特征[D]. 曾纹鑫. 重庆医科大学, 2019(12)
- [6]脑靶向siPD-L1和替莫唑胺共递送系统的构建及其抗耐药脑胶质瘤活性研究[D]. 刘道洲. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [7]RACK1在脑缺血再灌注损伤中的作用及作用机制的研究[D]. 李翔. 苏州大学, 2019(04)
- [8]TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制和多基因风险评分的预后价值[D]. 曹棉富. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [9]IDH1突变对胶质瘤干细胞辐射敏感性的影响及其机制研究[D]. 解婷. 苏州大学, 2019(06)
- [10]低氧促进胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移过程中相关microRNAs的作用机制研究[D]. 薛皓. 山东大学, 2016(09)