一、HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究(论文文献综述)
赵阳[1](2020)在《人腺病毒对树鼩原代细胞感染性的初步研究》文中提出人腺病毒(Human Adenovirus,HAd V)属于腺病毒科(Adenoviridae)哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus),是一种无包膜的线性双链DNA病毒。HAd V是一种分布广泛的传染性病原体,感染常诱发急性上、下呼吸道疾病和急性细支气管炎、肠胃炎、流行性结膜炎、角膜结膜炎、脑膜脑炎、膀胱炎、心肌炎甚至重症肺炎等疾病。HAd V感染通常具有自限性,但对免疫力低下的儿童及特殊人群,其感染可能会导致较为严重的后果。目前仍没有特效药及疫苗用于HAd V感染的治疗,由于HAd V感染大多数是轻微的且具有自限性,因此腺病毒感染临床治疗的重点大多是减轻患者的症状。HAd V的感染具有种属特异性,只能在自然宿主中有效感染及复制。针对HAd V的研究主要使用仓鼠、人源化小鼠和猪等动物,病毒类型主要为C种腺病毒HAd V5。C种HAd V虽然可以在仓鼠和人源化小鼠中进行复制,但有限的人源化基因和实验动物的免疫系统无法模拟人体免疫系统应对人腺病毒感染的情况。并且仓鼠等与人的进化关系,人体机能以及免疫耐受能力差别较大。建立合适的HAd V动物模型是亟待解决的关键问题。树鼩的全基因组测序进化分析以及生理解剖、神经发育和免疫反应等方面与灵长类和人类高度相似,比啮齿类动物更具有开发为模拟人类的潜在实验动物优势,已被广泛的应用于人类病毒性疾病研究。本研究首先通过腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)培养出HAd V3和HAd V7型病毒株。通过胰酶和胶原酶消化分离出状态良好的树鼩原代肺上皮细胞,经过鉴定后进行体外感染实验。通过对树鼩原代肺上皮细胞、树鼩原代肾上皮细胞以及树鼩真皮成纤维细胞感染HAd V3和HAd V7,结果证明树鼩原代肺上皮细胞对HAd V3和HAd V7的易感染远高于其他原代细胞(P<0.001)。对树鼩原代肺上皮的感染特性研究表明,感染后12 h-96 h病毒载量持续增加,与阳性对照组的增长趋势和病毒载量水平基本相似。通过单因素方差分析,TSLEC感染HAd V3和HAd V7分别在感染的第96 h和120 h时的病毒载量没有显着性差异(P<0.05)。对树鼩抗病毒相关炎症因子的检测发现,炎症因子的转录水平呈现出持续上升的趋势,其中IL-6及IL-10转录水平增加近百倍。综上所述TSLEC具有成为HAd V3和HAd V7感染细胞模型的潜力,为进一步探究HAd V树鼩模型的建立奠定了基础。
袁伦志[2](2019)在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中提出乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠(hBMSC-FRGS)体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
张义[3](2014)在《人脐血干细胞向类肝细胞分化和HBV体外感染类肝细胞初步研究》文中研究说明目的探讨体外培养人脐血单个核细胞向肝细胞的分化,体外感染HBV作为新的乙肝病毒感染的细胞模型。方法1采用LO-2细胞上清液诱导分离出脐血单个核细胞,连续检测10d AFP的情况,细胞传代后无诱导剂情况下检测ALB表达情况。2人HBV血清感染类肝细胞连续10d监测HBsAg、HBeAg表达情况。结果1通过ALB蛋白检测阳性结果表明成功诱导脐血干细胞向类肝细胞分化。2HBV感染类肝细胞后24h检测HBsAg、HBeAg有阳性表达。结论成功诱导分化出类肝细胞后并且能够作为乙肝病毒的体外宿主细胞进行培养,为后续乙肝病毒感染研究和抗病毒药物效果的研究奠定了基础。
宋修光[4](2012)在《1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达》文中研究说明研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是嗜肝DNA病毒属的一员。HBV可以引起肝脏的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织报道,全球20多亿人曾感染乙肝病毒,其中3.5亿以上为慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易彻底治愈,并且具有发展成肝硬化、肝癌的高度危险性。慢性乙型肝炎(CHB)是一个严重的公共卫生问题,每年全世界范围内约有一百万人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌。我国约有超过50%的居民曾被乙型肝炎病毒感染过,其中8%-15%的人成为慢性感染者。慢性乙型肝炎(CHB)治疗的目标是要实现的持续抑制HBV的复制,缓解肝脏疾病。乙型肝炎的治疗取决于几个因素,如疾病的阶段,“e”抗原的存在或缺失、耐药性、特别是在肝脏慢性疾病的终末期后期无有效药物治疗。因此,在治疗时机的选择及治疗过程中对以上因素的评价是非常重要的。干扰素a-2a(IFN2a)和干扰素α-2b干扰素(IFN2b)作为首选的治疗CHB已使用多年,治疗的目标是HBeAg血清转换,以激活免疫反应,改变免疫状态,目的是清除乙肝病毒DNA (HBVDNA)缓解疾病。然而,治疗费用昂贵且有许多副作用,如贫血、血红蛋白下降、恶心、呕吐,出冷汗等。而且仅约1/3患者用α-干扰素治疗持续应答。此外,核苷类似物不能完全消除病毒,并可能导致病毒基因突变。因此,开发新的抗病毒治疗药物仍然是一个重大的科研任务。但由于缺乏合适的HBV感染细胞模型或小动物模型来评价新的治疗策略而使CHB的治疗受到阻碍。目前,HepG2.2.15细胞系是最常用的体外研究HBV的细胞模型,HepG2.2.15细胞系作为公认的HBV全基因稳定表达细胞系,能支持HBV的复制,分泌感染性病毒颗粒。但因病毒基因以较为固定的拷贝数整合于宿主细胞染色体,表达水平低,其作为体外HBV感染细胞模型,尤其是作为抗病毒药物筛选和研究耐药突变株生物学特征的感染模型,受到了一定的局限。目前仍然迫切需要建立一个体外细胞培养或试验动物模型来帮助我们理解HBV感染中病毒-宿主相互作用,确定病毒突变体的致病性,检测新的抗病毒药物和对慢性感染治疗方法的选择。应用病毒基因的转导使细胞永生化是建立连续传代细胞系的一种方法。将SV40早期转录区基因导入细胞内是最常用的细胞永生化的方法,几乎适用于各种人类细胞类型。通过对SV40T基因介导的永生化细胞系的深入研究,多数研究结果显示SV40T基因的导入除提高转化细胞的生长速率外,能保留其原始细胞的许多分化表型,而非原始基因的表达很少见,在细胞水平上可反映其原始细胞的生物学特性,可作为体外研究的模型。1.3拷贝HBVDNA质粒含HBV完整复制体,基因组小于2.0拷贝,且复制和表达效率高于1.2和1.1拷贝,包含了HBV5’末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ,复制起始区(DR1、DR2)、前基因组转录起始位点x和前C区启动子,x开放读码框等,所以应用的最多。本研究的目的是构建SV40T永生化小鼠肝细胞系,观察1.3倍全基因HBV真核细胞表达质粒(pHBV1.3)在其细胞中的表达。希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。第一部分SV40T永生化小鼠肝细胞系的建立[目的]建立SV40T永生化小鼠肝细胞系,以作为后续实验研究的基础。[方法]1、建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。1.1、原代小鼠肝细胞的分离与培养。1.2、SV40T基因质粒(pRSV-T)扩增及抽提。1.3、利用脂质体lipofectamine2000介导pRSV-T质粒转染原代培养小鼠肝细胞。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系的检测。2.1、SV40T抗原检测:通过间接免疫荧光法检测SV40T抗原在小鼠肝细胞内的分布情况。2.2、形态学观察:在倒置相差显微镜下观察原代鼠肝细胞和SV40LT抗原永生化小鼠肝细胞的形态,同时在电子显微镜下对两种细胞进行超微结构观察。2.3、绘制原代及SV40T永生化小鼠肝细胞生长曲线,了解细胞生长周期。2.4、生化检测:测定原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)的含量。2.5、RT-PCR检测肝细胞系中ALB-mRNA的表达。2.6、免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞CK-18的免疫反应性。[结果]1、原代小鼠肝细胞的培养和转染:直接胶原酶消化法分离的肝细胞培养后,倒置相差显微镜下原代小鼠肝细胞形态扁平、呈多边形、通常多个细胞成串簇状排列,细胞呈单层贴壁、铺满瓶底。原代培养小鼠肝细胞经脂质体转染SV40L T抗原和50μ g/ml氨苄青霉素(Amp)筛选,于转染后30天出现一明显的上皮细胞样抗Amp的阳性克隆细胞。其余脂质体组和空白对照组细胞已大多死亡。2、SV40T抗原检测:转染后SV40T抗原免疫荧光逐渐增强,至转染后30天时可见明显荧光。胞浆内呈磨砂样荧光,细胞核内呈颗粒状荧光。3、转染肝细胞形态:原代及转染小鼠肝细胞均呈单层贴壁生长,形态呈上皮细胞样,原代小鼠细胞增殖缓慢,传代一次需7-9d。永生化小鼠肝细胞增殖明显比原代快,传代一次只需4-5d。在电子显微镜下,转染肝细胞与正常原代培养小鼠肝细胞相比无明显差异,呈典型的肝细胞形态与结构,细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见;细胞膜外可见典型的微状突起物;正在进行分裂的双核仁细胞体现了转染肝细胞体外增殖分化的过程。4、细胞生长曲线:在含10%的胎牛血清培养基中原代小鼠肝细胞生长缓慢,原代小鼠肝细胞在接种后第7天细胞增殖减缓。第8天开始出现细胞死亡。转化后的细胞于接种后第3-4日起增殖减缓,第5天开始出现细胞死亡。5、生化检测:原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养液上清液中ALT、AST、AFP的含量变化差异无显着性(P>O.05)。6、RT-PCR检测转染肝细胞中ALB mRNA的表达:对原代和转染小鼠肝细胞进行总RNA抽提和一步法RT-PCR扩增ALB-mRNA,结果2个标本在475bp处均出现明亮条带,表明转染肝细胞具有表达ALB mRNA的能力。7、Wostern blot检测原代、转染小鼠肝细胞角蛋白18(CK-18)免疫反应性:对原代、转染小鼠肝细胞进行蛋白质提取,经SDS-PAGE、Western blot检测,目的条带细胞CK-18显色均呈阳性,表明原代、转染肝细胞均具有CK-18免疫反应性。[结论]1、pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态、生长特性及功能,且在体外可以传代培养。可以进一步用来研究建立适宜于HBV感染的细胞模型。到目前为止,经过了五年多的冻存复苏和传代培养,SV40T永生化小鼠肝细胞已经传代50代次,传代、复苏和冻存不改变细胞的形态及增殖能力,细胞形态和生长特性没有明显改变。第二部分pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达[目的]观察pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达,希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。[方法]1、pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系:按脂质体转染试剂盒lipofectamine2000说明将pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系22代。2、pHBV1.3质粒在永生化小鼠肝细胞中的表达2.1、HBsAg及HBeAg的检测:用Abbott的AXSYM自动免疫分析仪及其配套的微粒子酶免分析法(MEIA)诊断试剂盒对转染细胞上清液进行HBsAg、HBeAg检测。2.2、间接免疫荧光检测细胞内HBsAg、HBcAg的表达:将SV40T永生化鼠肝细胞系22代细胞接种于24孔板,转染后24、48、72h用PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定,按试剂盒说明进行免疫荧光检测,兔抗一HBc以1:500稀释,鼠抗一HBs1:50稀释。2.3、Southern blot:提取转染后72h细胞内总DNA并纯化。将纯化的DNA样本点样于1%琼脂糖凝胶上电泳后,转移至硝酸纤维素膜上与地高辛标记的3.2KB全长HBVDNA探针杂交。地高辛标记及Southern试剂盒购于罗氏,方法按说明进行。2.4、透射电镜检测pHBVl.3质粒转染小鼠肝细胞培养液中HBV病毒颗粒:收集转染后72小时培养上清液,280000×g,4℃超速离心5小时弃去上清,沉淀用100μ L TN缓冲液溶解混匀。滴于有支持膜(0.3%Formvar)的铜网上,2%磷钨酸负染2分钟,室温中干燥30分钟,JEOL透射电镜(JEM-1200EX Electron Microscope)观察,拍照。[结果]1、转染24h后,细胞上清液中可检出HBsAg、HBeAg,72h达到高峰,96h呈下降趋势。转染细胞传代后细胞上清液中HBsAg、HBeAg呈下降趋势。传代至第4代时HBsAg、HBeAg均为阴性。2、转染24小时后,有HBsAg和HBcAg阳性细胞出现,72h细胞表达最强。HBsAg主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。3、Southern杂交检测转染细胞内HBVDNA的复制:转染后72h,转染细胞中存在3.5KB、2.4KB、2.1KB病毒复制中间体。4、电镜结果:收集转染后72小时细胞培养上清,超速离心后,沉淀用2%磷钨酸负染,JEM-1200EX透射电镜观察。电镜下可以见到少量直径42nm的双层壳状Dane颗粒和较多的直径22nm的小球型颗粒及少量丝状颗粒。[结论]经SV40T抗原转染的小鼠肝细胞系可以被pHBV1.3质粒二次转染,转染后HBV可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成病毒复制中间体。并且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、 HBeAg和HBcAg; pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。总结本研究结果证实,pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态和生长特性,且在体外可以传代培养。且可以被pHBVl.3质粒二次转染,转染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒复制中间体,且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg;pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。SV40T永生化小鼠肝细胞可以作为一个新型的适宜于HBV瞬时转染的细胞模型,为体外抗病毒药物筛选提供新的细胞模型。观察了HBVDNA在小鼠肝细胞内的复制情况,为建立人HBVDNA转染跨种属肝细胞模型奠定基础。
王姝,金敏,郭向飞,王新为,邱志刚,谌志强,李君文[5](2011)在《人胎肝干细胞体外感染乙型肝炎病毒模型的建立》文中认为目的建立一种稳定的基于人胎肝干细胞的维持乙型肝炎病毒(HBV)复制和传代的体外细胞培养模型,为深入研究乙肝病毒的生命周期和发病机制提供必要的工具。方法原代分离1220周胎龄的胎肝干细胞,用乙肝病毒阳性血清感染胎肝干细胞;荧光定量PCR追踪检测细胞上清和细胞内乙肝病毒DNA及细胞内乙肝病毒复制中间体—闭合环状双链DNA(cccDNA);化学发光法检测HBsAg、HBeAg分泌情况;免疫细胞化学法鉴定HBcAg表达情况;原位杂交检测细胞内病毒DNA。结果在经HBV感染的细胞上清液中可持续检测出乙肝病毒DNA、HBsAg和HBeAg,细胞内可检测出HBV-cccDNA和HBcAg。结论乙肝病毒可感染胎肝干细胞,并在细胞内增殖、分泌、传代,这一模型可模拟乙肝病毒自然感染人体的病理生理过程,为HBV感染机制研究和抗病毒药物的研发提供了必要的工具。
陈黎[6](2011)在《HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究》文中认为乙型肝炎是中国的流行病之一,全世界有3.5人口感染乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV),其中至少有1/3在中国。中国目前有约3000万慢性乙肝患者和1.2亿无症状的携带者。作为全球免疫疫苗联盟计划的一部分,中国最穷困的省份中至少有1千1百多万人口已经接种到了乙肝疫苗,但是这远远达不到免疫及控制乙型肝炎病毒的传播的程度。尽管大部分的研究人员认同胎儿感染及新生儿早期的垂直传播是HBV传播的主要途径和方式,但是由于具体机制尚不清楚,故在我国HBV感染的高危因素仍然不能确定。目前,人们把HBV的垂直传播主要分为3种不同的方式:胎儿的宫内感染、产时感染及产后感染。对于后两种传播途径而言,HBV疫苗和免疫球蛋白的应用可以有效阻止其传播。因此,更好地了解宫内感染所致的HBV宫内传播对于明确HBV的传播途径是至关重要的。在整个妊娠过程中,胎盘的结构和功能是动态变化。越来越多的证据显示,胎盘对于病毒从母体面到胎儿面的垂直传播中发挥非常重要的作用,如HBV、HCV、HIV及CMV病毒等。先天性的病毒感染可能引起产后感染、胎儿畸形、甚至是胎儿的死亡。虽然经胎盘传播病毒是这种感染的重要方面,但是关于病毒经胎盘的垂直传播及胎盘屏障在病毒从母体到胎儿循环中的传播中所发挥的作用研究还非常少。尽管对于血脑屏障已经有了非常深入的研究,但对于胎盘屏障的建立和鉴定还未见报道,导致宫内感染缺乏一个可靠的体外研究模型,严重影响病毒宫内感染机制的研究,制约了宫内感染的有效治疗。因此,构建一种胎盘屏障体外模型用于病毒宫内感染的研究是当前势在必行解决的问题,从而为病毒宫内感染机制的阐明和治疗方法的探索奠定坚实的基础。同时,已经被证实有3个基本的结构层面:滋养层细胞、间隙细胞(主要是胎盘的单核巨噬细胞,如Hofbauer细胞)及人胎盘微血管内皮细胞参与到宫内感染中。胎盘屏障主要由滋养层细胞、人胎盘微血管内皮细胞及两者的基底层所构成,是营养物质以及某些药物、病毒、激素等从母体进入胎儿的必经之路。本研究运用原代培养的滋养层细胞和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),采用三种不同的模式来构建胎盘屏障的体外模型:滋养层细胞单独培养,滋养层细胞和内皮细胞非接触性共培养及滋养层细胞和内皮细胞接触性共培养,发现两者的接触性共培养是能够最好的模拟正常胎盘结构和功能的体外胎盘屏障模型;然后我们利用病毒拷贝量高于107/ml HBV患者血清直接感染构建的胎盘屏障模型,进一步研究HBV病毒穿过及感染体外胎盘屏障模型的能力。基于HIV及CMV可以通过受体介导的方式引起宫内垂直感染,同时HBV可以感染外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte,PBMC),并在其中复制,我们推测HBV可能通过以下3种途径:1.机械性损伤:炎性反应所致直接或是间接损伤滋养层细胞或是脐静脉内皮细胞,产生细胞裂隙,导致基底膜通透性增高,从而HBV可以突破胎盘屏障第一层(滋养层细胞),然后释放入绒毛间质;2.细胞传递性:感染HBV的PBMC通过与滋养层细胞发生瞬时的微融合而将其内的HBV传递给后者,滋养层细胞再将HBV极性释放入绒毛间质;3.受体介导性:滋养层细胞顶膜侧上某种受体可能介导了游离完整HBV颗粒的进入并在其中复制,然后将部分HBV自其基底侧膜极性释放入绒毛间质。由于受体介导病毒入胞是其最常见的入侵细胞的方式和已经证实HBV在体情况下可以引起胎盘的损伤,所以本研究中,将关注机械性损伤和受体介导性病毒感染途径。HBV受体的探索虽然已经有20余年的历史,先后发现10余种可能的蛋白质,但高亲和力的HBV受体尚未发现。树突状细胞特异的C型外源凝集素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)通过甘露糖和海藻糖连接碳水化合物来识别病原微生物从而导致抗病毒的免疫反应。在许多糖化病毒免疫逃逸的过程中,DC-SIGN参与病毒进入并反式感染细胞的过程。同时,亦有研究证实其在HIV的母婴垂直传播中可能发挥重要的作用。除了在未成熟的树突状细胞上有分布和表达外,DC-SIGN也可以在PBMC、胎盘的血管内皮细胞、胎盘巨噬细胞中表达。我们前期的预实验结果也发现,DC-SIGN可以在滋养层细胞上表达。迄今为止,DC-SIGN作为受体的病毒包括HIV、CMV、埃博拉病毒(Ebola virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),SARS冠状病毒及麻疹等(未见与HBV的相关报道)。所有的结构基础是与病原体的N-高甘露糖型糖链特异性结合,而HBV被膜蛋白的PreS2抗原也存在N-高甘露糖型糖链,HBV有与DC-SIGN结合的结构基础。鉴于DC-SIGN在胎盘上的分布,我们大胆推测DC-SIGN可能和HBV的宫内感染相关。基于以上分析,本课题首先是利用原代培养的滋养层细胞和人脐静脉内皮细胞构建一种胎盘屏障体外模型,并进行系统评价与鉴定;其次,采用HBV病毒感染胎盘屏障体外模型,明确胎盘屏障在HBV宫内感染可能的作用;然后应用胎盘屏障模型进一步研究DC-SIGN在HBV垂直传播中的可能作用,从而为HBV宫内感染机制研究与治疗提供新的实验依据。主要实验结果和结论如下:1、采用胰酶与DNA酶序贯消化法分离人早孕滋养层细胞,通过35%与45%Percoll两个梯度的不连续密度梯度离心对分离细胞加以纯化,使细胞产量达106/g以上。然后用抗HLA-DR的免疫磁珠进一步纯化早孕的绒毛滋养层细胞。应用细胞角蛋白和波形蛋白免疫细胞化学标记,发现细胞纯度达到90%以上,可从数量及纯度上满足后续体外感染要求。利用HUVEC和绒毛滋养层细胞接触共培养构建胎盘屏障体外模型,扫描电镜结果显示滋养层细胞穿过Tranwell小室,与HUVEC接触性共生长;透射电镜和激光共聚焦结果表明屏障构建后,细胞之间存在大量紧密连接;跨膜电阻检测发现构建的胎盘屏障能有效提高跨膜电阻;因此,构建的体外模型从功能和形态符合胎盘屏障的要求,为后续实验奠定基础。2、采用血清直接感染法进行滋养层细胞的HBV感染,模拟自然状态下HBV分别感染胎盘屏障中的滋养层细胞及内皮细胞,然后感染构建的胎盘体外屏障,探讨HBV感染胎盘屏障的可能性。结果显示HBV DNA在感染后的滋养层细胞及HUVEC的上清液中释放分别在72-96h及48-72h达到高峰。分别应用HBsAg、与CK7及Ⅷ相关抗原、HBcAg与CD105进行免疫组化双标染色,发现HBV可以感染人滋养层细胞和HUVEC及胎盘屏障的体外模型。而且胎盘屏障可以部分阻止HBV穿透母体面至胎儿面,所以在感染后的24h,共培养体系的外室上清液中HBV DNA仅能一过性的达到103/ml。尝试用不同检测法(传统的PCR法、Hirt法及质粒抽提法)检测感染HBV复制的金标准HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),感染HBV后的胎盘屏障未能检测出HBV cccDNA,所以HBV在胎盘屏障中是一过性的感染还是可以复制,尚没有定论。但至少,扫描电镜中我们在HBV感染后的体外模型中发现了HBV病毒样的颗粒。3、分别采用DC-SIGN抗体及siRNA基因沉默DC-SIGN试验,初步探讨DC-SIGN在HBV宫内传播中的作用,发现DC-SIGN抗体及RNA小片段干扰技术基因沉默DC-SIGN在HBV感染滋养层细胞和HUVEC的过程中有阻断作用,但对于体外构建的胎盘屏障阻断作用未见明显差异。进一步通过受体DC-SIGN重建,利用DC-SIGN质粒转染人胎肝细胞验证DC-SIGN增加了人胎肝细胞HBV易感性,故DC-SIGN是HBV经受体介导性进入胎盘屏障的宫内传播中的可能受体之一。以上结果表明,我们第一次成功构建了人胎盘屏障体外培养模型,也证实HBV可能从滋养层面向内皮细胞面穿过;尽管屏障本身对于病毒的侵入起到一定的阻断作用,HBV DNA在细胞共培养体系中仍然有一过性的增高;同时,高拷贝量的HBV病毒对于HUVEC有机械性损伤,但是共培养中未发现同样的现象;初步探讨通过DC-SIGN这个受体介导HBV入侵滋养层细胞的宫内传播的机制,旨在为HBV宫内感染机制的研究奠定实验基础,为宫内干预提供新的靶标。早产是临床上新生儿致死或是致畸的主要原因之一。尽管在过去20年中,对于早产已展开了深入的实验室和临床研究,其发生率仍然增高超过30%。早产发生主要是产程过早发动,其主要原因有宫内感染、子宫过度牵张和胎盘早剥。正是这些临床病理因素将子宫从静息状态变为收缩,从而导致分娩的发动。3’,5’-环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)作为经典的第二信使,影响了一系列的人体生理和病理反应,包括平滑肌的收缩和炎症反应。事实上,不仅生理状态下产生的化学物质(如松弛素、促肾上腺皮质激素分泌激素及降钙素基因相关肽),就连病理状态下产生的化学物质(如β2肾上腺素激动剂)均是通过cAMP引发子宫舒张。但是,临床上我们也发现除了药物本身的对人体的副作用和快速抗药物反应外,其可能下调人体内?2肾上腺素激动剂受体的表达。所以,需要寻找才一种新的可以增高cAMP水平的其他机制,最近在对于小鼠的研究中发现,磷酸二酯酶4型抑制剂——rolipram,可以降低早产的发生。前列腺素(prostaglandins,PGs)对于早产和足月产产程发动,宫颈成熟和促进子宫肌收缩都发挥非常关键的作用。在临床治疗中,这些特性一方面用于诱导分娩的发生,另一方面前列腺素合成酶抑制剂又应用于抑制早产的发生。目前已知环氧合酶至少有3种不同亚型在子宫平滑肌上表达,而表达最多的环氧合酶2型。环氧合酶-2 (cyclo-oxygenase-2,COX-2)常被转录和转录后水平上被调控,能被生长因子,细胞因子及内毒素刺激增高;在产程发动后,子宫肌和羊膜层中COX-2的表达均上调。我们前面实验中研究证实炎性细胞因子IL-1β可以通过NF-κB增高COX-2的表达,而且IL-1β和牵张也可以通过MAPK上调COX-2的表达。已经有研究表明在不同的组织中cAMP能够降低NF-κB和MAPK活性。然而新近研究发现,PGI2可以通过cAMP/PKA信号转导通路导致一系列收缩相关蛋白的表达,如连接蛋白43、α-平滑肌肌动蛋白、h-钙调蛋白结合蛋白、钙结合蛋白、平滑肌肌凝蛋白重链,这一结果提示在某些特定的信号下,cAMP可能在分娩发动前促进子宫肌的活性。临床上某些cAMP激动剂作为抑制宫缩的药物,可能在某些特殊的环境下也能引起子宫的收缩,所以本研究中我们发现cAMP能够上调COX-2的表达并对其机制进行研究。主要实验结果和结论如下:1、利用不同的cAMP激动剂(8-bromo-cAMP、forskolin、rolipram)在不同浓度作用不同时间刺激原代培养的子宫肌细胞,结果发现8bromo-cAMP提高COX-2表达在6和24h,rolipram和forskolin也用相似的生物学效应。随后的浓度依赖性实验发现,在1、6h时相点,forskolin增高COX-2 mRNA。同时COX-2蛋白合成水平的测试得到相似的趋势结果。ELISA结果也提示COX-2作用产物PGE2、PGI2、PGF2?生成在24和48h是持续增高的。2、采用cAMP下游效应物(PKA、EPAC、AMPK)的激动剂、抑制剂、shRNA技术基因沉默作用于子宫肌细胞,结果显示这些效应即不能被目前所知的cAMP下游效应物(PKA、EPAC和AMPK)激动剂所复制,也不能被其特异的抑制剂所阻截;shRNA技术基因沉默这些效应物,甚至是PDZ-GEF1,2,也不能抑制cAMP对COX-2调节作用。3、进一步利用有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路及下游底物验证发现,cAMP通过MAPK信号通路提高COX-2的表达,而PGE2通过其效应物EP-2,再影响MAPK活性,最后促进COX-2的表达。以上结果表明,cAMP能够有效提高子宫肌细胞COX-2的表达,主要通过MAPK信号通路增加COX-2表达,COX-2活性的提高导致PGE2、PGI2、PGF2?生成增高,而PGE2通过其效应物EP-2,再影响MAPK活性,最终反馈调节COX-2的表达。为明确cAMP在子宫肌上的功能机制提供新的实验依据。
王选举,黄正明,宋建国[7](2009)在《乙型肝炎病毒感染模型的研究进展》文中指出HBV感染是影响人类健康的主要问题之一。HBV的生物学研究及治疗方法进展缓慢是由于缺乏合适的体内外模型。如何建立一种有效的HBV感染模型,对于探索其感染机制,寻找有效的防治方法及开展抗HBV药物的筛选都具有重要的科研及临床意义。随着医学科学的不断发展,国内外学者进行了大量的研究,建立了多种HBV感染的体内外模型,每一种模型都有其优势和弊端,本文简要综述了各种模型在HBV研究中的应用进展及相应优、缺点。
王学军[8](2009)在《乙型肝炎病毒侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定》文中研究说明乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属嗜肝DNA病毒科,是已知感染人类最小的DNA病毒。HBV感染不仅可以引起急、慢性肝炎,而且还与肝硬化、肝癌的发生、发展密切相关。自二十世纪六十年代HBV发现以来,通过转染肝细胞的方法对HBV的基因组成、复制、包装、分泌等过程了解的已比较清楚,但由于缺乏简单易得的体外感染细胞模型,HBV感染的早期机制如HBV的黏附、胞吞、脱壳等过程尚未得到阐明。HBV属包膜病毒,它的感染进入过程主要是HBV表面蛋白与HBV受体等宿主分子的互作过程。在HBV受体迟迟未能得到阐明的情况下,我们认为对HBV表面蛋白各个结构域在HBV侵染肝细胞过程中的作用进行鉴定是必要的,这不仅有利于深入理解HBV侵染肝细胞的机制,对HBV受体的发现以及基于HBV侵染机制的新型抗HBV药物的研发都具有重要的意义。现有HBV体外感染细胞模型所接种病毒一般采用了HBV本身或者HBV的卫星病毒丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus,HDV),两者广泛应用于HBV侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定,但两者均无法考察对其包装分泌必需的结构域。最近,研究者将HBV表面蛋白与慢病毒载体共转染293T细胞成功包装了HBV假病毒(HBV pseudotype particles,HBVpp),并证明HBVpp具有与HBV感染相似的机制。HBVpp的包装成功,为研究HBV表面蛋白进入相关结构域带来了新方法,因此本研究决定采用HBVpp和在我国较容易获取的树鼩原代肝细胞(primary tupaia hepatocytes,PTH)建立HBVpp-PTH体外HBV感染替代细胞模型,并尝试利用此模型对HBV表面蛋白的“preS2结构域、跨膜结构域I、跨膜结构域II、S结构域的Cys-107、L蛋白羧基端结构以及S蛋白”在HBV侵染肝细胞过程中的作用进行鉴定。首先,通过建立一种简易方便的肝原位两步灌注法成功分离得到PTH,每只动物的细胞得率达到1×108个左右,细胞活力平均在90%,平均贴壁率达到70%以上,并筛选出一种较好的PTH冻存配方,PTH冻存复苏后细胞贴壁率平均达到40%;然后通过将HBV表面蛋白质粒和慢病毒载体共转染293T细胞的方法进行了HBVpp的包装生产并对HBVpp感染特性进行了分析,发现HBVpp仅能感染对HBV易感的PTH,而对HBV不易感的大鼠原代肝细胞(primary rat hepatocytes,PRH)、HepG2和293T细胞对HBVpp同样不易感,并且preS1抗体能够特异性的阻断HBVpp感染PTH;其次利用建立的HBVpp-PTH模型考察了已知对HBV感染重要的豆蔻酰化修饰、不必要的M蛋白以及L蛋白的胞内区I在HBVpp感染中的作用,所得结论与文献利用HBV/HDV研究结论一致。以上结果充分表明HBVpp-PTH模型可以用于HBV侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定研究。通过构建HBV表面蛋白结构域的系列缺失替换质粒并通过WB、ELISA的方法对这些重组蛋白的表达和分泌特性进行了分析,结果表明凡是含有preS1结构域的HBV重组表面蛋白均表达于细胞内而无分泌特性;对S蛋白的研究表明,跨膜结构域I、Cys-107、羧基端结构域的缺失和替换均会造成重组蛋白分泌特性的丧失或严重降低。HBV/HDV的包装生产依赖于S蛋白的分泌,因此这些结构域无法应用现有的HBV/HDV模型来进行研究。HBVpp的包装生产无特异性,仅需HBV表面蛋白分布于细胞膜即可。通过流式的方法对各种HBV重组表面蛋白在细胞膜的表达进行了分析,发现其均可以少量表达于细胞膜表面(部分表达量较高)。利用HBV重组表面蛋白质粒、慢病毒包装质粒和含eGFP基因的慢病毒载体共转染293T细胞的方法进行了各种HBVpp的包装生产并考察了其对PTH、PRH、HepG2和293T细胞的感染特异性,发现所有HBVpp对PRH、HepG2和293T细胞均无感染性,部分HBVpp可以感染PTH。根据感染性HBVpp包装所用HBV重组表面蛋白的特点,总结得出以下结论:1. preS2结构域的整体缺失不影响HBVpp的感染进入(但要达到最优感染效果需要preS1结构域羧基端氨基酸的共同缺失)。2.跨膜结构域I的存在对HBVpp的感染进入是必要的,但可以被无融合肽活性的其他跨膜结构域所替代,提示其在HBVpp进入中不起融合肽作用。3.跨膜结构域II对HBV表面蛋白的整体结构至关重要,现尚无法确定其在HBVpp感染进入过程中的作用。4. S结构域Cys-107对HBVpp的感染进入不是必要的。5. HBV表面蛋白羧基端21个氨基酸的缺失不影响HBVpp的感染进入。6. S蛋白对HBVpp的感染进入过程不必要,但其可以提高L蛋白在细胞膜的分布从而增强HBVpp的感染性,同时L蛋白的S结构域必须与preS1结构域位于同一条肽链上才能介导HBVpp的感染进入。随后对筛选出的具有结构域代表性和较高感染效率的HBVpp的滴度进行了测定,并利用感染抑制试验进行了进一步的反向验证,证明HBVpp的感染与HBV具有同样的preS1结构域依赖性。综上所述,HBVpp与HBV感染机制相似,采用HBVpp-PTH模型鉴定HBVpp侵染肝细胞相关HBV表面蛋白结构域所得上述结论应当适用于HBV自身。
张晶晶[9](2008)在《树鼩、小鼠HBx、ras转基因模型及体外HBV感染模型的研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在肝癌病因学方面,目前倾向于多因素、多步骤发生且多个因素间交互作用的观点。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是肝癌最重要的病因之一,在发展中国家尤为突出。全世界大约有53%,我国约90%的HCC病例与HBV相关。近来的研究表明乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者发生HCC的机率是非感染者的25~37倍。因此,研究HBV的感染和致癌机理无疑有着重要的意义。但因缺乏体外的增殖系统和易获得的动物模型、细胞模型,HBV感染肝脏的早期机理研究进展较为缓慢,从而在一定程度上影响乙型肝炎及其相关肝病的研究。本研究尝试用睾丸介导基因转移法(TMGT),构建转HBx、ras基因树鼩和小鼠,为从整体水平研究HBV感染诱发肝癌作用的机制提供理想的动物模型。另一方面,选用树鼩作为原代肝细胞的供体,成功构建了HBV感染树鼩肝细胞的体外模型,并在此基础上初步探讨了HBx在HBV感染中的作用及抗病毒药物干扰素-a的作用靶点。第一部分HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建目的通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及pcDNA3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法用Oliga6.0结合Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中(血清型Adrq+)分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5.01和Vector NTISuite 8.0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3.1(+)质粒中。结果成功克隆了基因型C型突变型HBx基因,并构建出真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx。新基因被GeneBank接受,在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明,新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性(97.8%),2.2%的变异。结论从广西HBsAg阳性病人病毒株(血清型Adrq+)中发现了新的基因型C型突变型HBx基因(mutant genotype C)。pcDNA3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,将为进一步构建转HBx基因树鼩模型并研究HBx基因肝癌发生过程中的作用打下基础。第二部分K-ras突变基因真核表达载体的构建及在不同来源肝细胞株中的表达目的构建携带突变K-ras基因,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达载体,导入两种不同的肝细胞株中表达。方法PCR扩增突变K-ras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7.5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察EGFP在细胞中的表达;用Western blot方法验证K-ras-EGFP融合蛋白的表达。结果酶切和测序证实pEGFP-N1-K-ras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的K-ras基因的3’端;在Huh 7.5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19%和53%;Western blot也检测到融合蛋白的表达。结论通过基因克隆方法成功构建了pEGFP-N1-K-ras重组质粒载体,并且在Huh7.5和LMH中均稳定表达,为下一步构建K-ras转基因树鼩及研究K-ras在肝癌发生中的作用奠定了基础。第三部分精原干细胞转染法制备转基因小鼠、树鼩的研究目的探索树鼩人工繁殖和育幼的方法和以精原干细胞转染法制备乙肝病毒X基因(HBx)及突变ras基因的转基因动物的可行性。方法成年雄雌树鼩按1∶1或1∶2配对,根据动物间的适应和受孕情况调整成相对固定的繁殖对。给所有动物建立档案,记录树鼩的生产情况,记录仔动物的每日体重、进食量和健康情况。对仔树鼩用三种方法进行人工喂养,即配方乳喂养、被动和主动母乳喂养。将构建携带HBx基因和突变ras基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBx及pEGFP-N1-K-ras用脂质体包被,注入5只雄性小鼠和14只雄性树鼩睾丸组织中。注射后4周,将上述处理过的雄性动物与雌性动物合笼交配。小鼠出生后2~4周后剪其尾尖,仔树鼩出生后1个月取其肝组织作活检,并以多聚酶链式反应(PCR)检测目的基因是否整合入基因组DNA。结果注射的小鼠和树鼩都具有繁殖能力,共产仔小鼠35只,仔树鼩33只。3只仔鼠PCR结果阳性(阳性率8.6%),其中两只仔鼠HBx基因阳性,1只仔鼠HBx、ras基因均为阳性。2只仔树鼩HBx基因阳性(阳性率6.1%)。结论表明以精原细胞作为载体,建立带HBx及ras基因的动物模型是可行的,为进一步研究HBx及K-ras基因在肝癌发生中的作用奠定了基础。第四部分两种原代树鼩肝细胞的分离和培养方法的研究目的探讨体外培养原代树购肝细胞的分离方法。方法以成年树鼩和新生树鼩做为肝供体,分别采用体外两步灌流法和Percoll梯度离心方法获取肝细胞并进行体外培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在相差倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测培养细胞活性,并采用PAS染色法鉴定。结果分离收获成年树鼩肝细胞较新生树鼩肝细胞存活率高;培养过程中,新生树鼩肝细胞较成年树鼩肝细胞生长快,增殖能力强,具有统计学意义;PAS染色观察,新生树鼩和成年树鼩肝细胞中充满大量糖原颗粒,两者差异无显着性。结论两种方法均可用于原代树鼩肝细胞的体外培养。第五部分人乙肝病毒体外感染树鼩肝原代细胞的研究目的为进一步研究人类乙肝病毒(HBV)提供接近自然感染状态的理想细胞模型。方法体外二步灌流法分离树鼩原代肝细胞,纯化后的乙型肝炎病人血清感染上述肝细胞,用Southern blot和Northern blot检测感染后细胞内的DNA和RNA,用ELISA方法检测细胞上清的HBsAg,用免疫组化检测细胞内HBsAg的表达。结果可检测出肝细胞内cccDNA、ssDNA、pgRNA和sgRNA,感染后第7天,信号开始增强,持续到实验结束的第14天。细胞上清中HBsAg自第1天到第5天S/CO值逐渐下降,随后S/CO值逐渐升高。感染后14天,用免疫组化法可检测到树鼩肝细胞胞浆内的HBsAg抗原表达,阳性率约10%。结论HBV可在原代树鼩肝细胞中稳定复制和表达。第六部分人乙肝病毒感染树鼩原代肝细胞模型的应用第一章HBx失活的乙肝病毒可感染树鼩原代肝细胞目的研究HBx蛋白在HBV复制中的作用。方法用含有HBX21(HBx基因的起始端插入终止密码子而失活)的HBV质粒瞬时转染Huh7.5肝细胞株,用Southern blot检测转染后细胞内的HBV DNA,用Western blot方法检测HBx蛋白的表达。收集转染后第5天的细胞上清并用PEG2000纯化后,接种到体外培养的树鼩原代肝细胞中,收集感染后第8天的树鼩肝细胞,提取细胞总DNA后用Southern blot检测HBV DNA。结果转染HBV(HBX21)质粒的Huh 7.5细胞中未检测到HBx蛋白的表达,可检测到ssDNA,感染后的树鼩原代细胞中可以检测到cccDNA。结论HBV复制中间体的出现证明HBx失活的HBV以转染和感染两种方式进入细胞后都可以在胞内复制,HBx在HBV复制循环中没有起到关键作用。第二章干扰素-α抑制人类乙肝病毒复制的研究目的在体外感染HBV的模型中研究IFN-a对HBV复制的影响,探讨其抑制病毒复制的作用靶点。方法不同剂量IFN-a作用于感染HBV的树鼩原代肝细胞5天后,用ELISA试剂盒测定细胞上清中HBsAg的分泌表达水平,用Southern blot检测HBV DNA,用Northern blot方法检测MxA和HBV RNA。结果IFN-a可以诱导MxA的生成,抑制培养细胞上清液中HBsAg的分泌和复制中间体pgRNA和sgRNA的生成,且呈剂量依赖性,但对cccDNA无明显抑制作用。结论IFN-a在体外HBV感染的PTH模型中可抑制病毒复制。
王方,王小红,王宇明,汤勃,张俊,张静,李得明[10](2007)在《HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定》文中认为目的:建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库,并从中克隆鉴定出新的应答基因.方法:分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA,用SMART PCR技术合成全长双链cDNA,经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组,分别衔接两个不同的接头,再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR,将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,挑取克隆进行筛选排除假阳性,再行序列分析,鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因.结果:成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库,得到158个白色的克隆,随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个,长约100400bp,经筛选后得到70个克隆,测序表明有16个差异表达的基因,其中可能的新基因有5个.结论:用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库,为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础,初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.
二、HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究(论文提纲范文)
(1)人腺病毒对树鼩原代细胞感染性的初步研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩写词表 |
第一章 绪论 |
1.1 人腺病毒的生物学特性 |
1.1.1 腺病毒病毒粒子的结构及组成 |
1.1.2 腺病毒的复制机制 |
1.1.3 腺病毒宿主范围 |
1.2 腺病毒流行感染与致病 |
1.3 腺病毒的分型 |
1.4 腺病毒的治疗与预防 |
1.5 腺病毒的工程化应用 |
1.5.1 腺病毒载体的类型及优化 |
1.5.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
1.5.3 腺病毒载体用于基因治疗 |
1.6 腺病毒相关动物模型研究进展 |
1.6.1 棉鼠 |
1.6.2 叙利亚仓鼠 |
1.6.3 转基因鼠 |
1.6.4 猪 |
1.6.5 非人灵长类 |
1.7 树鼩生物学特性及应用 |
1.7.1 树鼩相关病毒感染模型 |
1.7.1.1 肝炎病毒树鼩感染模型 |
1.7.1.2 疱疹病毒树鼩感染模型 |
1.8 研究的意义 |
1.9 本研究的技术路线 |
第二章 HAdV的培养及滴度测定 |
2.1 引言 |
2.2 材料与设备 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 主要试验仪器 |
2.2.3 试剂配制方法 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 HAdV的培养 |
2.3.1.1 HAdV在A549中的培养 |
2.3.1.2 HAdV在293T中的培养 |
2.3.2 HAdV在A549中增值特性的测定 |
2.3.3 HAdV病毒滴度的测定 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 HAdV在A549中的培养 |
2.4.2 HAdV在A549中增值特性的测定 |
2.4.3 HAdV病毒滴度的测定 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第三章 树鼩原代细胞的分离培养和鉴定 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 主要实验仪器 |
3.2.3 试剂配制方法 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 树鼩肺上皮细胞的分离培养及优化 |
3.3.2 树鼩原代肺部成纤维细胞分离和培养 |
3.3.3 树鼩原代肾上皮细胞分离和培养 |
3.3.4 树鼩原代真皮成纤维细胞分离和培养 |
3.3.5 树鼩原代细胞鉴定 |
3.3.6 树鼩肺上皮细胞增殖能力测定 |
3.4 结果与分析 |
3.4.1 树鼩原代细胞的培养 |
3.4.2 树鼩原代细胞免疫荧光鉴定 |
3.4.3 树鼩肺上皮细胞增值能力测定 |
3.5 讨论 |
3.6 小结 |
第四章 人腺病毒体外感染特性研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料与设备 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 主要仪器和设备 |
4.2.3 试剂配置方法 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 .人腺病毒DNA提取 |
4.3.2 HAd V感染树鼩原代细胞RNA提取 |
4.3.3 PCR引物设计合成 |
4.3.3.1 PCR反应体系及反应条件优化 |
4.3.3.2 标准品的制备 |
4.3.3.3 荧光定量PCR体系 |
4.3.3.4 绘制标准曲线 |
4.4 腺病毒体外感染腺病毒 |
4.3.1 树鼩不同组织细胞的易感性探究 |
4.3.2 HAdV最佳感染复数的探究 |
4.3.3 HAdV感染树鼩原代肺上皮细胞 |
4.3.4 HAdV感染原代细胞后细胞因子的检测 |
4.5 实验结果与分析 |
4.5.1 标准曲线的建立 |
4.5.2 不同组织原代细胞易感性 |
4.5.3 HAdV最佳感染复数的探究 |
4.5.4 感染树鼩原代肺上皮细胞 |
4.5.5 HAdV感染树鼩原代肺上皮细胞炎症因子的检测结果 |
4.6 讨论 |
4.7 小结 |
第五章 结论与展望 |
5.1 结论 |
5.2 展望 |
致谢 |
参考文献 |
附录A 攻读硕士期间发表论文 |
(2)人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 前言 |
1. 乙型肝炎病毒 |
1.1 HBV的起源与进化 |
1.2 HBV的病毒结构 |
1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
2.1 HBV感染的主要宿主 |
2.2 HBV的全球流行状况 |
2.3 HBV感染的自然历史过程 |
2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
4.1 灵长类HBV感染模型 |
4.2 树鼩HBV感染模型 |
4.3 土拨鼠替代模型 |
4.4 北京鸭替代模型 |
4.5 HBV转基因小鼠 |
4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
4.7.5 FRGS小鼠模型 |
4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
6. 本研究的目的、意义和思路 |
第二章 材料与方法 |
7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
7.1 主要仪器 |
7.2 常规耗材 |
7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
7.4 定性和定量检测试剂盒 |
7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
7.6 常规PCR引物 |
7.7 常规抗体和荧光素 |
7.8 实验动物和细胞 |
8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
8.1 ELISA/CLEIA检测 |
8.2 Western Blot检测 |
8.3 细胞免疫荧光实验 |
8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
8.5 常规流式细胞技术 |
8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
10.4 肝硬化诊断方法 |
11. 数据处理与统计分析 |
第三章 结果与分析 |
第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
12.1 hBMSCs表型鉴定 |
12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
12.9 第一部分小结 |
第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
13.3 第二部分小结 |
第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
14.6 第三部分小结 |
第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
15.4 第四部分小结 |
第四章 讨论 |
16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
第五章 结论和展望 |
参考文献 |
致谢 |
在校期间科研成果 |
(3)人脐血干细胞向类肝细胞分化和HBV体外感染类肝细胞初步研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
1、综述 |
参考文献 |
2、论文 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
硕士在读期间发表的论文 |
致谢 |
(4)1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达(论文提纲范文)
目录 |
CONTENTS |
中文摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
综述 |
综述(一) |
参考文献 |
综述 (二) |
参考文献 |
前言 |
第一部分 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第二部分 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的文章 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
英文文章1 |
英文文章2 |
(6)HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究(论文提纲范文)
常用英文缩写一览表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
论文正文 HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2 表达的机制研究 |
前言 |
分题一 HBV宫内感染体外模型的构建 |
前言 |
第一部分 人胎盘屏障体外模型的构建、优化及鉴定 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第二部分 HBV感染胎盘屏障体外模型的研究 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第三部分 DC-SIGN在HBV感染胎盘屏障体外模型中的作用 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
分题一总结 |
照片 |
参考文献 |
分题二 cAMP调控子宫肌细胞COX-2 表达的机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
分题二总结 |
致谢 |
参考文献 |
文献综述 HBV宫内感染研究进展 |
参考文献 |
研究生期间发表的论文 |
(7)乙型肝炎病毒感染模型的研究进展(论文提纲范文)
1 体外模型 |
1.1 2.2.15细胞系统 |
1.2 HBV-杆状病毒-HepG2系统 |
1.3 Ad-HBV1.3-HepG2系统 |
1.4 原代人胎肝细胞培养模型 |
2 体内模型 |
2.1 嗜肝DNA病毒模型 |
2.2 HBV复制小鼠模型 |
2.2.1 HBV转基因小鼠模型 |
2.2.2 HBV转染小鼠模型 |
2.2.2.1重组腺病毒载体介导的病毒感染模型 |
2.2.2.2流体动力学注射HBV DNA导致的病毒感染模型 |
2.3 人-鼠嵌合肝脏模型 |
(8)乙型肝炎病毒侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 HBV 假病毒体外感染细胞模型的建立 |
一、材料与方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
第二部分 乙型肝炎病毒侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定 |
第一节 乙型肝炎病毒侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的筛选 |
一、材料与方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
第二节 乙型肝炎病毒侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的验证 |
一、材料与方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
附录一 缩略词表 |
附录二 主要仪器和常用试剂 |
附录三 引物序列 |
(9)树鼩、小鼠HBx、ras转基因模型及体外HBV感染模型的研究(论文提纲范文)
主要英文缩写 |
摘要 |
英文摘要 |
引言 |
参考文献 |
第一部分 HBx基因的克隆、序列分析及其真核表达载体的构建 |
前言 |
一 材料与方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
参考文献 |
第二部分 K-ras突变基因真核表达载体的构建及在肝细胞株中的表达 |
前言 |
一 材料和方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
参考文献 |
第三部分 精原干细胞转染法制备转基因小鼠、树鼩的研究 |
前言 |
一 材料与方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
参考文献 |
第四部分 两种原代树鼩肝细胞的分离和培养方法的研究 |
前言 |
一 材料与方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
参考文献 |
第五部分 人类乙肝病毒体外感染树鼩肝原代细胞的研究 |
前言 |
一 材料与方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
参考文献 |
第六部分 人乙肝病毒感染树鼩原代肝细胞模型的应用 |
前言 |
第一章 HBx失活的乙肝病毒可感染树鼩原代肝细胞 |
一 材料与方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
第二章 干扰素-a抑制人类乙肝病毒复制的研究 |
一 材料与方法 |
1 材料 |
2 方法 |
二 结果 |
三 讨论 |
参考文献 |
第七部分 结论与展望 |
一 结论 |
二 本论文的创新之处 |
三 有待于进一步开展的工作 |
四 展望 |
综述一 乙型肝炎病毒体内外相关模型研究进展 |
参考文献 |
综述二 乙型肝炎病毒研究进展 |
参考文献 |
在读期间发表的论文 |
致谢 |
四、HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究(论文参考文献)
- [1]人腺病毒对树鼩原代细胞感染性的初步研究[D]. 赵阳. 昆明理工大学, 2020(05)
- [2]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [3]人脐血干细胞向类肝细胞分化和HBV体外感染类肝细胞初步研究[D]. 张义. 大理学院, 2014(01)
- [4]1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达[D]. 宋修光. 山东大学, 2012(04)
- [5]人胎肝干细胞体外感染乙型肝炎病毒模型的建立[J]. 王姝,金敏,郭向飞,王新为,邱志刚,谌志强,李君文. 解放军预防医学杂志, 2011(03)
- [6]HBV宫内感染体外模型的构建及cAMP调控子宫肌细胞COX-2表达的机制研究[D]. 陈黎. 第三军医大学, 2011(07)
- [7]乙型肝炎病毒感染模型的研究进展[J]. 王选举,黄正明,宋建国. 传染病信息, 2009(03)
- [8]乙型肝炎病毒侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定[D]. 王学军. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(09)
- [9]树鼩、小鼠HBx、ras转基因模型及体外HBV感染模型的研究[D]. 张晶晶. 广西医科大学, 2008(10)
- [10]HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定[J]. 王方,王小红,王宇明,汤勃,张俊,张静,李得明. 第四军医大学学报, 2007(23)